ARN can thiệp nhỏ (siRNA – small interfering RNA)

Cấu trúc

siRNA là phân tử ARN sợi đôi, thường có cấu trúc xoắn kép thuận tay phải kiểu A. Mỗi sợi thường có 2 nucleotide nhô ra ở đầu 3′, được gọi là “đuôi thừa”. Đặc điểm quan trọng của siRNA là sự phosphoryl hoá ở đầu 5′ của một sợi và thường không phosphoryl hoá ở đầu 5′ của sợi đối diện. Sự khác biệt này đóng vai trò trong việc siRNA được RIC (RNA-induced silencing complex) nhận diện và sử dụng. Chi tiết hơn, sợi có đầu 5′ phosphoryl hoá sẽ được RIC kết hợp và trở thành sợi hướng dẫn (guide strand), quyết định tính đặc hiệu của quá trình RNAi. Sợi còn lại (passenger strand) sẽ bị loại bỏ.

Cơ chế hoạt động

Quá trình can thiệp ARN bởi siRNA trải qua các bước sau:

1. Khởi đầu: siRNA ngoại lai (ví dụ: từ virus) hoặc siRNA nội sinh (được tạo ra trong tế bào) được đưa vào tế bào.
2. Hình thành phức hợp RISC: siRNA liên kết với một phức hợp protein được gọi là phức hợp silencing induced by RNA (RISC). Trong RISC, một sợi của siRNA (sợi “hướng dẫn”) được giữ lại, trong khi sợi kia (sợi “chống hướng dẫn” hoặc “passenger”) bị loại bỏ và phân hủy. Việc lựa chọn sợi hướng dẫn phụ thuộc vào năng lượng liên kết ở đầu 5′ của mỗi sợi; sợi có đầu 5′ liên kết yếu hơn thường được chọn làm sợi hướng dẫn.
3. Nhắm mục tiêu mRNA: Sợi hướng dẫn của siRNA dẫn dắt phức hợp RISC đến phân tử mRNA đích, bằng cách bắt cặp bazơ bổ sung.
4. Phân cắt mRNA hoặc ức chế dịch mã: Nếu sự bắt cặp bazơ giữa siRNA và mRNA là hoàn toàn hoặc gần như hoàn toàn bổ sung, thì một thành phần enzyme của RISC (thường là Argonaute 2) sẽ phân cắt mRNA đích. mRNA bị phân cắt sau đó bị phân hủy, ngăn cản sự dịch mã và biểu hiện gen. Trong một số trường hợp, nếu sự bắt cặp bazơ không hoàn toàn bổ sung, siRNA có thể ức chế sự dịch mã của mRNA mà không gây ra sự phân cắt.

Chức năng

siRNA đóng nhiều vai trò quan trọng trong tế bào, bao gồm:

• Phòng thủ chống lại virus: siRNA đóng một vai trò quan trọng trong việc bảo vệ tế bào chống lại sự nhiễm virus bằng cách nhắm mục tiêu và phân hủy ARN virus.
• Điều hòa biểu hiện gen: siRNA nội sinh tham gia vào việc điều hòa biểu hiện gen của chính tế bào, bằng cách kiểm soát mức độ mRNA của các gen cụ thể. Điều này góp phần vào sự phát triển, biệt hoá và phản ứng của tế bào với stress.
• Ứng dụng nghiên cứu và trị liệu: siRNA được sử dụng rộng rãi trong nghiên cứu để “knockdown” (ức chế) biểu hiện của các gen cụ thể, giúp nghiên cứu chức năng của chúng. siRNA cũng đang được phát triển như một liệu pháp tiềm năng cho các bệnh như ung thư, các bệnh nhiễm trùng do virus và các rối loạn di truyền.

So sánh siRNA và miRNA

Mặc dù cả siRNA và microRNA (miRNA) đều tham gia vào RNAi, chúng có một số điểm khác biệt:

siRNA là một công cụ mạnh mẽ của tế bào để điều hòa biểu hiện gen và bảo vệ chống lại virus. Việc tìm hiểu về siRNA và RNAi đã mở ra những hướng đi mới cho nghiên cứu sinh học và phát triển các liệu pháp điều trị bệnh.

Thách thức và triển vọng trong ứng dụng siRNA cho mục đích điều trị

Mặc dù siRNA mang tiềm năng lớn trong điều trị bệnh, vẫn còn một số thách thức cần vượt qua:

• Giao siRNA đến đích: Việc đưa siRNA đến các tế bào hoặc mô đích một cách hiệu quả là một thách thức lớn. Kích thước nhỏ và điện tích âm của siRNA khiến nó khó xuyên qua màng tế bào. Các phương pháp phân phối bao gồm sử dụng các vector virus, các hạt nano lipid, các chất liên hợp hóa học và các kỹ thuật phân phối không chứa vector như tiêm tĩnh mạch áp lực cao.
• Độ ổn định và thời gian bán hủy: siRNA có thể bị phân hủy nhanh chóng trong máu và các mô bởi các nuclease. Cần thiết phải phát triển các chiến lược để tăng cường độ ổn định và kéo dài thời gian bán hủy của siRNA, ví dụ như sửa đổi hóa học các nucleotide của siRNA.
• Tác dụng ngoài mục tiêu: siRNA có thể liên kết với các mRNA ngoài mục tiêu và gây ra các tác dụng không mong muốn. Cần phải thiết kế siRNA sao cho có tính đặc hiệu cao đối với mRNA đích. Các thuật toán tiên tiến và phương pháp sàng lọc được sử dụng để tối ưu hóa tính đặc hiệu của siRNA.
• Đáp ứng miễn dịch: siRNA có thể kích hoạt đáp ứng miễn dịch bẩm sinh, dẫn đến viêm và các tác dụng phụ khác. Cần phải tối ưu hóa thiết kế và phương pháp phân phối siRNA để giảm thiểu đáp ứng miễn dịch. Ví dụ, sử dụng siRNA đã được biến đổi hóa học có thể giúp tránh kích hoạt hệ thống miễn dịch.

Tuy nhiên, nghiên cứu đang được tiến hành để giải quyết những thách thức này, và một số loại thuốc dựa trên siRNA đã được phê duyệt cho sử dụng lâm sàng, cho thấy tiềm năng to lớn của công nghệ này trong tương lai. Các lĩnh vực nghiên cứu đang tập trung vào việc cải thiện hiệu quả phân phối, tăng cường độ ổn định, giảm thiểu tác dụng ngoài mục tiêu và giảm đáp ứng miễn dịch. Các phương pháp phân phối mới, chẳng hạn như các hạt nano lipid nhắm mục tiêu và các chất liên hợp, đang được phát triển để cải thiện việc phân phối siRNA đến các mô đích. Ngoài ra, việc sửa đổi hóa học siRNA có thể tăng cường độ ổn định và giảm tác dụng ngoài mục tiêu.

Một số ví dụ ứng dụng của siRNA:

• Điều trị bệnh ung thư: siRNA có thể được sử dụng để ức chế biểu hiện của các gen gây ung thư, chẳng hạn như oncogene.
• Điều trị bệnh do virus: siRNA có thể được sử dụng để nhắm mục tiêu và phân hủy ARN virus, ức chế sự nhân lên của virus.
• Điều trị bệnh di truyền: siRNA có thể được sử dụng để ức chế biểu hiện của các gen đột biến gây ra bệnh di truyền. Tuy nhiên, việc ứng dụng siRNA trong điều trị bệnh di truyền đòi hỏi phương pháp phân phối hiệu quả và bền vững đến các tế bào bị ảnh hưởng.

• Fire A, Xu S, Montgomery MK, Kostas SA, Driver SE, Mello CC. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature. 1998;391(6669):806-811.
• Elbashir SM, Harborth J, Lendeckel W, Yalcin A, Weber K, Tuschl T. Duplexes of 21-nucleotide RNAs mediate RNA interference in cultured mammalian cells. Nature. 2001;411(6836):494-498.
• Hannon GJ. RNA interference. Nature. 2002;418(6894):244-251.

Câu hỏi và Giải đáp

Cơ chế phân cắt mRNA bởi phức hợp RISC diễn ra chính xác như thế nào?

Trả lời: Sau khi sợi hướng dẫn của siRNA dẫn dắt RISC đến mRNA đích, enzyme Argonaute 2 (Ago2) trong RISC sẽ phân cắt mRNA tại vị trí bắt cặp bổ sung với siRNA, thường là ở giữa vị trí nucleotide thứ 10 và 11 tính từ đầu 5′ của siRNA. Sự phân cắt này chia mRNA thành hai đoạn, sau đó bị phân hủy bởi các enzyme exonuclease trong tế bào.

Ngoài Argonaute 2, còn protein nào khác tham gia vào phức hợp RISC và chúng có chức năng gì?

Trả lời: Phức hợp RISC chứa nhiều protein khác ngoài Ago2, bao gồm các protein thuộc họ Dicer và TRBP. Dicer đóng vai trò trong việc xử lý siRNA từ các phân tử ARN sợi đôi dài hơn. TRBP giúp cho việc gắn kết siRNA với Ago2 và ổn định phức hợp RISC.

Làm thế nào để thiết kế siRNA đặc hiệu cho một gen đích?

Trả lời: Việc thiết kế siRNA đặc hiệu đòi hỏi phải lựa chọn các trình tự nucleotide có tính đặc hiệu cao cho mRNA đích và tuân theo một số quy tắc thiết kế, chẳng hạn như quy tắc về hàm lượng GC, vị trí của các nucleotide A/U ở đầu 3′, và tránh các trình tự tương đồng với các gen khác. Các công cụ sinh tin học và các thuật toán dự đoán cũng được sử dụng để hỗ trợ quá trình thiết kế.

Những hạn chế nào của việc sử dụng vector virus để phân phối siRNA?

Trả lời: Mặc dù vector virus có hiệu quả trong việc đưa siRNA vào tế bào, chúng có thể gây ra một số hạn chế, bao gồm: độc tính, khả năng gây đột biến do tích hợp vào genome của tế bào chủ, kích thích đáp ứng miễn dịch, và khó khăn trong việc sản xuất quy mô lớn.

Ngoài việc phân cắt mRNA, siRNA còn có cơ chế tác động nào khác trong quá trình điều hòa gen?

Trả lời: Ngoài việc phân cắt mRNA, siRNA còn có thể tác động lên quá trình điều hòa gen thông qua các cơ chế khác như: ức chế dịch mã bằng cách ngăn chặn ribosome liên kết với mRNA, hoặc điều chỉnh cấu trúc chromatin bằng cách methyl hóa DNA hoặc sửa đổi histone. Tuy nhiên, cơ chế phân cắt mRNA vẫn là cơ chế tác động chính và được nghiên cứu nhiều nhất của siRNA.