Bắt giữ kháng nguyên (Antigen Capture)

Nguyên lý

Kỹ thuật bắt giữ kháng nguyên sử dụng kháng thể đặc hiệu với kháng nguyên đích được cố định trên một bề mặt rắn, ví dụ như đáy giếng của đĩa microtiter, hạt từ tính, hoặc màng nitrocellulose. Khi mẫu chứa kháng nguyên được thêm vào, kháng nguyên đích sẽ liên kết đặc hiệu với kháng thể đã cố định. Các thành phần không liên kết được rửa trôi, chỉ để lại kháng nguyên đích bị bắt giữ. Sau đó, kháng nguyên bị bắt giữ có thể được phát hiện bằng nhiều phương pháp khác nhau, tùy thuộc vào mục đích của thí nghiệm.

Các phương pháp phát hiện

Có nhiều phương pháp phát hiện kháng nguyên đã bắt giữ, bao gồm:

• Sử dụng kháng thể thứ hai được đánh dấu: Một kháng thể thứ hai đặc hiệu với một epitope khác của kháng nguyên đích (epitope là một phần của kháng nguyên mà kháng thể nhận biết và liên kết), được gắn với một phân tử đánh dấu như enzyme (ví dụ: horseradish peroxidase – HRP, alkaline phosphatase – AP), chất phát huỳnh quang, hoặc đồng vị phóng xạ, được thêm vào. Kháng thể thứ hai này sẽ liên kết với kháng nguyên đã bị bắt giữ. Tín hiệu từ phân tử đánh dấu sau đó được đo để định lượng kháng nguyên. Ví dụ, nếu sử dụng HRP, phản ứng với cơ chất sẽ tạo ra sản phẩm có màu, cường độ màu tỷ lệ thuận với lượng kháng nguyên.
• Phương pháp cạnh tranh (Competitive assay): Trong phương pháp này, một lượng đã biết kháng nguyên đích được đánh dấu, sẽ cạnh tranh với kháng nguyên không đánh dấu trong mẫu để liên kết với kháng thể bắt giữ. Lượng kháng nguyên đánh dấu liên kết sẽ tỷ lệ nghịch với lượng kháng nguyên không đánh dấu trong mẫu. Như vậy, nếu mẫu có càng nhiều kháng nguyên, thì tín hiệu thu được (từ kháng nguyên đánh dấu) càng ít và ngược lại.
• Phương pháp kẹp (Sandwich assay): Đây là phương pháp phổ biến nhất và có độ nhạy, độ đặc hiệu cao. Phương pháp này sử dụng hai kháng thể khác nhau đặc hiệu với các epitope khác nhau của kháng nguyên đích. Một kháng thể được cố định để bắt giữ kháng nguyên (kháng thể bắt giữ), và kháng thể thứ hai được đánh dấu để phát hiện kháng nguyên đã bị bắt giữ (kháng thể phát hiện). Kháng nguyên đóng vai trò như “nhân bánh” được “kẹp” giữa hai kháng thể. Tín hiệu thu được tỷ lệ thuận với lượng kháng nguyên trong mẫu.

Ưu điểm

Kỹ thuật bắt giữ kháng nguyên có một số ưu điểm vượt trội:

• Độ đặc hiệu cao: Kỹ thuật bắt giữ kháng nguyên cho phép phát hiện đặc hiệu kháng nguyên đích trong mẫu phức tạp, nhờ vào tính đặc hiệu của kháng thể.
• Độ nhạy cao: Có thể phát hiện được lượng kháng nguyên rất nhỏ, nhờ vào việc khuếch đại tín hiệu (ví dụ: dùng enzyme) hoặc dùng phương pháp sandwich.
• Định lượng được: Cho phép xác định nồng độ, hay định lượng, lượng kháng nguyên có trong mẫu, thông qua việc dựng đường chuẩn (standard curve).
• Ứng dụng rộng rãi: Được sử dụng trong nhiều lĩnh vực như chẩn đoán bệnh, nghiên cứu khoa học (tìm kiếm các biomarker), và kiểm soát chất lượng (thực phẩm, dược phẩm,…).

Ứng dụng

Kỹ thuật bắt giữ kháng nguyên có rất nhiều ứng dụng quan trọng, bao gồm:

• Chẩn đoán bệnh truyền nhiễm: Phát hiện kháng nguyên của virus (ví dụ: HIV, HBV, HCV, SARS-CoV-2), vi khuẩn (ví dụ: Streptococcus, Staphylococcus), và ký sinh trùng (ví dụ: Plasmodium gây bệnh sốt rét).
• Chẩn đoán ung thư: Phát hiện các dấu ấn ung thư (tumor markers), là các phân tử được sản xuất bởi tế bào ung thư hoặc bởi cơ thể để đáp ứng với sự hiện diện của khối u. Ví dụ: PSA (prostate-specific antigen) trong ung thư tuyến tiền liệt, CA 125 (cancer antigen 125) trong ung thư buồng trứng.
• Theo dõi đáp ứng miễn dịch: Đo lường nồng độ cytokine (các phân tử truyền tín hiệu giữa các tế bào miễn dịch) và chemokine (các cytokine gây ra sự di chuyển của tế bào) để đánh giá tình trạng viêm, đáp ứng với điều trị,…
• Kiểm soát chất lượng thực phẩm: Phát hiện các chất gây ô nhiễm trong thực phẩm, ví dụ như độc tố vi khuẩn, dư lượng thuốc trừ sâu, các chất gây dị ứng (allergen).
• Nghiên cứu khoa học: Nghiên cứu tương tác kháng nguyên-kháng thể, các quá trình sinh học khác, phát triển các liệu pháp điều trị mới (ví dụ: kháng thể trị liệu).

Các xét nghiệm nhanh kháng nguyên SARS-CoV-2 (test kit) là một ví dụ điển hình về ứng dụng của kỹ thuật bắt giữ kháng nguyên. Trong xét nghiệm này, kháng thể đặc hiệu với protein nucleocapsid (N) của virus được cố định trên một que thử. Nếu mẫu bệnh phẩm (dịch tỵ hầu) chứa virus, protein N sẽ bị kháng thể bắt giữ. Sau đó, một kháng thể thứ hai (cũng đặc hiệu với protein N) được gắn hạt màu sẽ liên kết với protein N đã bị bắt giữ, tạo thành một vạch màu trên que thử, cho biết kết quả dương tính.

Tóm lại, kỹ thuật bắt giữ kháng nguyên là một công cụ mạnh mẽ và linh hoạt được sử dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực. Sự kết hợp giữa độ đặc hiệu, độ nhạy, và khả năng định lượng làm cho kỹ thuật này trở thành một phương pháp quan trọng trong nghiên cứu và chẩn đoán.

Các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu quả của kỹ thuật bắt giữ kháng nguyên

Hiệu quả của kỹ thuật bắt giữ kháng nguyên phụ thuộc vào nhiều yếu tố, bao gồm:

• Độ đặc hiệu và ái lực của kháng thể: Kháng thể bắt giữ và phát hiện phải có độ đặc hiệu và ái lực cao với kháng nguyên đích để đảm bảo tính chính xác và độ nhạy của phép thử. Ái lực ($K_D$) là hằng số phân ly, thể hiện độ mạnh của liên kết giữa kháng thể và kháng nguyên; $K_D$ càng nhỏ thì ái lực càng cao.
• Nồng độ kháng thể: Nồng độ kháng thể phải được tối ưu hóa để đạt được hiệu quả bắt giữ và phát hiện tốt nhất. Nồng độ quá thấp sẽ làm giảm độ nhạy, trong khi nồng độ quá cao có thể gây ra hiện tượng liên kết không đặc hiệu (nhiễu nền).
• Điều kiện phản ứng: Các yếu tố như pH, nhiệt độ, và thời gian ủ ảnh hưởng đến liên kết kháng nguyên-kháng thể và cần được tối ưu hóa cho từng hệ thống cụ thể.
• Xử lý mẫu: Việc xử lý mẫu đúng cách, ví dụ như ly giải tế bào, loại bỏ các chất gây nhiễu, rất quan trọng để đảm bảo kháng nguyên đích được giải phóng và có thể liên kết với kháng thể bắt giữ.
• Lựa chọn phương pháp phát hiện: Phương pháp phát hiện cần được lựa chọn dựa trên yêu cầu về độ nhạy, chi phí, và thiết bị sẵn có.

Các biến thể của kỹ thuật bắt giữ kháng nguyên

Có nhiều biến thể của kỹ thuật bắt giữ kháng nguyên, được phát triển để phù hợp với các ứng dụng và mục đích khác nhau:

• ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay): Là một trong những phương pháp phổ biến nhất sử dụng kỹ thuật bắt giữ kháng nguyên, dựa trên việc sử dụng enzyme để phát hiện kháng nguyên. Phản ứng enzyme-cơ chất tạo ra sản phẩm có màu, cường độ màu tỷ lệ với lượng kháng nguyên.
• ELISpot (Enzyme-Linked Immunospot Assay): Được sử dụng để phát hiện và định lượng các tế bào tiết ra một protein cụ thể, ví dụ như cytokine. Các tế bào được nuôi cấy trên một đĩa có phủ kháng thể bắt giữ. Protein do tế bào tiết ra sẽ bị bắt giữ và được phát hiện bằng kháng thể thứ hai gắn enzyme, tạo ra các đốm màu (spot) tương ứng với từng tế bào.
• Immunofluorescence assay (Xét nghiệm miễn dịch huỳnh quang): Sử dụng kháng thể được gắn với chất phát huỳnh quang để phát hiện kháng nguyên. Khi chiếu ánh sáng có bước sóng thích hợp, chất huỳnh quang sẽ phát sáng, cho phép quan sát và định vị kháng nguyên trong mẫu (ví dụ: trên mô, tế bào).
• Magnetic bead-based assay (Xét nghiệm dựa trên hạt từ tính): Sử dụng hạt từ tính được phủ kháng thể để bắt giữ kháng nguyên, giúp dễ dàng tách kháng nguyên khỏi mẫu phức tạp bằng cách sử dụng nam châm.

Hạn chế của kỹ thuật bắt giữ kháng nguyên

Mặc dù có nhiều ưu điểm, kỹ thuật bắt giữ kháng nguyên cũng có một số hạn chế:

• Khả năng phản ứng chéo: Kháng thể có thể liên kết với các kháng nguyên có cấu trúc tương tự (không phải kháng nguyên đích), dẫn đến kết quả dương tính giả.
• Ảnh hưởng của matrix effect: Các thành phần trong mẫu (matrix) có thể ảnh hưởng đến liên kết kháng nguyên-kháng thể, gây ra kết quả không chính xác (quá cao hoặc quá thấp).
• Chi phí: Một số phương pháp phát hiện (ví dụ: sử dụng đồng vị phóng xạ) hoặc một số loại kháng thể đặc hiệu có thể tốn kém.

KẾT LUẬN:

Kỹ thuật bắt giữ kháng nguyên là một công cụ quan trọng trong nghiên cứu và chẩn đoán, cung cấp một phương pháp đặc hiệu và nhạy để phát hiện và định lượng kháng nguyên. Việc hiểu rõ nguyên lý, ưu điểm, hạn chế, và các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu quả của kỹ thuật này là cần thiết để áp dụng nó một cách hiệu quả và chính xác.

• Harlow, E., & Lane, D. (1988). Antibodies: A laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory.
• Wild, D. (Ed.). (2013). The immunoassay handbook. Elsevier.
• Crowther, J. R. (2001). ELISA: Theory and practice. Humana Press.

Câu hỏi và Giải đáp

Ngoài ELISA, ELISpot và Immunofluorescence, còn có những kỹ thuật nào khác sử dụng nguyên lý bắt giữ kháng nguyên?

Trả lời: Có nhiều kỹ thuật khác dựa trên nguyên lý bắt giữ kháng nguyên, bao gồm: kỹ thuật sắc ký miễn dịch (immunochromatography), kỹ thuật cộng hưởng plasmon bề mặt (Surface Plasmon Resonance – SPR), kỹ thuật vi cân thạch anh (Quartz Crystal Microbalance – QCM), và cytometric bead array (CBA). Mỗi kỹ thuật này có những ưu điểm và hạn chế riêng, phù hợp với các ứng dụng cụ thể.

Làm thế nào để tối ưu hóa nồng độ kháng thể bắt giữ và kháng thể phát hiện trong một ELISA sandwich?

Trả lời: Tối ưu hóa nồng độ kháng thể thường được thực hiện bằng phương pháp “checkerboard titration”. Trong phương pháp này, các nồng độ khác nhau của kháng thể bắt giữ và kháng thể phát hiện được thử nghiệm trong một loạt giếng trên đĩa ELISA. Nồng độ tối ưu là nồng độ cho tín hiệu mạnh nhất với nền thấp nhất.

“Matrix effect” là gì và làm thế nào để giảm thiểu ảnh hưởng của nó trong kỹ thuật bắt giữ kháng nguyên?

Trả lời: “Matrix effect” là ảnh hưởng của các thành phần trong mẫu (ví dụ như protein, lipid, muối) lên liên kết kháng nguyên-kháng thể, dẫn đến kết quả không chính xác. Để giảm thiểu ảnh hưởng này, có thể sử dụng các phương pháp như pha loãng mẫu, sử dụng dung dịch blocking, hoặc sử dụng các kỹ thuật tách chiết để loại bỏ các chất gây nhiễu.

Kỹ thuật bắt giữ kháng nguyên có thể được sử dụng để phát hiện các phân tử nào ngoài protein?

Trả lời: Ngoài protein, kỹ thuật bắt giữ kháng nguyên có thể được sử dụng để phát hiện nhiều loại phân tử khác, bao gồm hormone, carbohydrate, axit nucleic, hapten (các phân tử nhỏ có khả năng kích thích đáp ứng miễn dịch khi liên kết với protein mang), thuốc trừ sâu, và độc tố.

So sánh ưu điểm và nhược điểm của việc sử dụng kháng thể đa dòng (polyclonal) và kháng thể đơn dòng (monoclonal) trong kỹ thuật bắt giữ kháng nguyên.

Trả lời: Kháng thể đa dòng nhận diện nhiều epitope trên kháng nguyên, cho tín hiệu mạnh hơn nhưng có thể kém đặc hiệu hơn. Kháng thể đơn dòng chỉ nhận diện một epitope duy nhất, cho độ đặc hiệu cao hơn nhưng tín hiệu có thể yếu hơn. Việc lựa chọn loại kháng thể phụ thuộc vào ứng dụng cụ thể và yêu cầu về độ nhạy và độ đặc hiệu.