Chẩn đoán dựa trên CRISPR (CRISPR-Based Diagnostics)

Nguyên lý hoạt động

Hệ thống CRISPR-Cas, ban đầu được phát hiện như một cơ chế miễn dịch thích nghi ở vi khuẩn, bao gồm hai thành phần chính:

• CRISPR RNA (crRNA): Một đoạn RNA ngắn được thiết kế để bổ sung với một trình tự DNA hoặc RNA đích cụ thể.
• Protein Cas: Một enzyme endonuclease (ví dụ: Cas9, Cas12, Cas13) được crRNA hướng dẫn để cắt DNA hoặc RNA đích.

Trong chẩn đoán dựa trên CRISPR, crRNA được thiết kế để nhắm mục tiêu vào một trình tự nucleic đặc hiệu của mầm bệnh hoặc dấu ấn sinh học. Khi crRNA liên kết với trình tự đích, protein Cas được kích hoạt để cắt không chỉ đích mà còn cả các trình tự nucleic không đặc hiệu khác (đối với một số protein Cas như Cas12a và Cas13). Hoạt động “cắt phụ thuộc mục tiêu” này được khai thác để tạo ra tín hiệu có thể phát hiện được, thường thông qua việc sử dụng chất nền huỳnh quang hoặc điện hóa. Cụ thể hơn, tín hiệu huỳnh quang được tạo ra khi protein Cas cắt một phân tử mang tín hiệu huỳnh quang, trong khi tín hiệu điện hóa được tạo ra thông qua việc sử dụng các điện cực để đo sự thay đổi dòng điện khi protein Cas cắt một phân tử gắn trên điện cực. Việc lựa chọn phương pháp phát hiện tín hiệu phụ thuộc vào thiết kế cụ thể của hệ thống chẩn đoán CRISPR.

Các loại chẩn đoán dựa trên CRISPR

Một số hệ thống CRISPR-Cas khác nhau đã được điều chỉnh cho mục đích chẩn đoán, bao gồm:

• Cas12a: Hệ thống này thể hiện hoạt động “cắt phụ thuộc mục tiêu” mạnh mẽ trên DNA đơn sợi, làm cho nó phù hợp để phát hiện DNA. Một ví dụ là thử nghiệm SHERLOCK (Specific High-sensitivity Enzymatic Reporter unLOCKing). SHERLOCK sử dụng Cas12a để phát hiện trình tự DNA đích, sau đó kích hoạt hoạt tính cắt không đặc hiệu của Cas12a lên các phân tử DNA ủ tín hiệu huỳnh quang, tạo ra tín hiệu có thể đo lường được.
• Cas13a: Hệ thống này nhắm mục tiêu RNA và cũng thể hiện hoạt động “cắt phụ thuộc mục tiêu” trên RNA đơn sợi, hữu ích cho việc phát hiện RNA virus. Một ví dụ là thử nghiệm DETECTR (DNA Endonuclease Targeted CRISPR Trans Reporter). Tương tự SHERLOCK, DETECTR sử dụng Cas13a để nhận diện RNA đích và sau đó kích hoạt hoạt động cắt các phân tử RNA mang tín hiệu huỳnh quang.
• Cas9: Mặc dù Cas9 chủ yếu được sử dụng để chỉnh sửa gen, nó cũng có thể được sử dụng cho mục đích chẩn đoán bằng cách kết hợp với các chiến lược khuếch đại tín hiệu khác. Ví dụ, Cas9 có thể được sử dụng kết hợp với PCR kỹ thuật số để tăng độ nhạy của phép đo.

Ưu điểm của chẩn đoán dựa trên CRISPR

• Độ nhạy cao: Có thể phát hiện ngay cả một lượng nhỏ các axit nucleic đích.
• Tính đặc hiệu cao: Nhắm mục tiêu chính xác các trình tự nucleic cụ thể, giảm thiểu kết quả dương tính giả.
• Nhanh chóng: Cung cấp kết quả trong vòng vài phút đến vài giờ.
• Chi phí thấp: Tiềm năng cho việc sản xuất hàng loạt với chi phí thấp.
• Đơn giản: Dễ dàng thực hiện, phù hợp cho việc chẩn đoán tại chỗ.

Ứng dụng

Chẩn đoán dựa trên CRISPR có một loạt các ứng dụng tiềm năng, bao gồm:

• Phát hiện mầm bệnh truyền nhiễm (ví dụ: virus, vi khuẩn, ký sinh trùng)
• Chẩn đoán ung thư (phát hiện các đột biến gen liên quan đến ung thư)
• Xác định đột biến di truyền (xét nghiệm sàng lọc các bệnh di truyền)
• Theo dõi kháng thuốc kháng sinh
• Chẩn đoán bệnh di truyền

Thách thức

Mặc dù đầy hứa hẹn, chẩn đoán dựa trên CRISPR vẫn phải đối mặt với một số thách thức:

• Off-target effects: Khả năng protein Cas cắt ở các vị trí không mong muốn, dẫn đến kết quả dương tính giả. Việc giảm thiểu tác dụng ngoài mục tiêu là rất quan trọng để đảm bảo độ chính xác của chẩn đoán.
• Khuếch đại tín hiệu: Cần thiết cho việc phát hiện các axit nucleic ở nồng độ thấp. Các phương pháp khuếch đại tín hiệu hiệu quả là cần thiết để tăng độ nhạy của xét nghiệm.
• Tính ổn định và phân phối: Đảm bảo tính ổn định của các thành phần CRISPR-Cas và phát triển các phương pháp phân phối hiệu quả. Điều này đặc biệt quan trọng đối với việc triển khai chẩn đoán tại chỗ ở các khu vực có nguồn lực hạn chế.

Chẩn đoán dựa trên CRISPR: Một công nghệ đột phá

Chẩn đoán dựa trên CRISPR là một công nghệ đột phá với tiềm năng cách mạng hóa chẩn đoán bệnh. Bằng cách khai thác sức mạnh và tính đặc hiệu của hệ thống CRISPR-Cas, các nhà nghiên cứu đang phát triển các phương pháp chẩn đoán nhanh chóng, nhạy, đặc hiệu và chi phí thấp cho một loạt các bệnh. Mặc dù vẫn còn một số thách thức cần được giải quyết, chẩn đoán dựa trên CRISPR hứa hẹn sẽ cải thiện đáng kể khả năng tiếp cận chăm sóc sức khỏe toàn cầu và thay đổi cách chúng ta chẩn đoán và điều trị bệnh.

Các phương pháp khuếch đại tín hiệu

Để tăng độ nhạy của chẩn đoán dựa trên CRISPR, thường cần phải khuếch đại tín hiệu. Một số phương pháp khuếch đại tín hiệu thường được sử dụng bao gồm:

• Khuếch đại đẳng nhiệt (Isothermal amplification): Các kỹ thuật như Phản ứng khuếch đại dựa trên vòng lặp (Loop-mediated isothermal amplification – LAMP) và Khuếch đại dựa trên sự dịch chuyển sợi (Recombinase polymerase amplification – RPA) có thể khuếch đại nhanh chóng các trình tự nucleic đích ở nhiệt độ không đổi, loại bỏ nhu cầu về thiết bị PCR tốn kém.
• Huỳnh quang: Sử dụng chất nền huỳnh quang được protein Cas kích hoạt khi cắt để tạo ra tín hiệu phát huỳnh quang có thể dễ dàng phát hiện.
• Điện hóa: Đo lường thay đổi tín hiệu điện hóa do hoạt động của protein Cas gây ra.
• Phương pháp dựa trên dải thử nghiệm bên (Lateral flow assay): Kết hợp chẩn đoán dựa trên CRISPR với dải thử nghiệm bên để phát hiện bằng mắt thường, cho phép chẩn đoán tại chỗ nhanh chóng và dễ dàng.

So sánh với các phương pháp chẩn đoán khác

Nghiên cứu và phát triển trong tương lai

Các lĩnh vực nghiên cứu và phát triển trong tương lai cho chẩn đoán dựa trên CRISPR bao gồm:

• Cải thiện tính đặc hiệu và giảm thiểu off-target effects: Phát triển các biến thể protein Cas mới với độ chính xác cao hơn.
• Đa tầng (Multiplexing): Phát hiện đồng thời nhiều mầm bệnh hoặc dấu ấn sinh học trong một lần thử nghiệm.
• Tích hợp với các thiết bị di động: Phát triển các thiết bị chẩn đoán cầm tay dựa trên CRISPR cho việc chẩn đoán tại chỗ.
• Tự động hóa: Tự động hóa quy trình chẩn đoán để giảm thiểu lỗi của con người và tăng thông lượng.