Chiết tách DNA (DNA Extraction)

• Xét nghiệm di truyền: Chẩn đoán bệnh, xác định quan hệ huyết thống, pháp y.
• Sinh học tổng hợp: Tạo ra các chuỗi DNA mới.
• Nghiên cứu khoa học: Nghiên cứu cấu trúc và chức năng của gen, di truyền học quần thể, tiến hóa phân tử.
• Công nghệ sinh học: Sản xuất protein tái tổ hợp, liệu pháp gen.
• Chẩn đoán bệnh truyền nhiễm: Phát hiện và định lượng mầm bệnh.

Nguyên tắc cơ bản của chiết tách DNA

Quá trình chiết tách DNA dựa trên các đặc tính hóa lý của DNA và các thành phần khác của tế bào. Các bước chính thường bao gồm:

Phá vỡ tế bào (Cell lysis): Sử dụng các phương pháp cơ học (nghiền, xay, siêu âm), hóa học (detergent như SDS, enzyme như lysozyme), hoặc kết hợp cả hai để phá vỡ màng tế bào và màng nhân, giải phóng DNA vào dung dịch. Detergent làm tan màng lipid, còn enzyme phân hủy thành tế bào.
Loại bỏ protein và các tạp chất khác: Sử dụng các enzyme protease (như proteinase K) để phân hủy protein. Các tạp chất khác như RNA có thể được loại bỏ bằng RNase. Muối (như NaCl) và dung môi hữu cơ (như phenol, chloroform) cũng được sử dụng để tách protein và lipid ra khỏi DNA.  Việc sử dụng phenol/chloroform tạo ra một hỗn hợp hai pha: pha nước chứa DNA và pha hữu cơ chứa protein và lipid. Sau bước này, DNA thường tồn tại dưới dạng hòa tan trong pha nước.
Tủa DNA: DNA được tủa bằng ethanol lạnh hoặc isopropanol lạnh trong môi trường có muối. DNA không tan trong cồn và sẽ kết tủa thành dạng sợi. Việc thêm cồn làm giảm hằng số điện môi của dung dịch, cho phép DNA kết tủa.
Rửa và hòa tan DNA: DNA kết tủa được rửa bằng cồn 70% để loại bỏ muối dư thừa và các tạp chất khác. Sau đó, DNA được hòa tan trong nước hoặc dung dịch đệm TE (Tris-EDTA) để bảo quản. Dung dịch TE có pH kiềm giúp ổn định DNA và EDTA chelate các ion kim loại, ức chế hoạt động của các enzyme nuclease có thể phân hủy DNA.

Các phương pháp chiết tách DNA

Có nhiều phương pháp chiết tách DNA khác nhau, tùy thuộc vào nguồn mẫu và mục đích sử dụng. Một số phương pháp phổ biến bao gồm:

• Chiết tách bằng phenol-chloroform: Phương pháp cổ điển và hiệu quả, cho phép thu được DNA với độ tinh sạch cao. Tuy nhiên, sử dụng hóa chất độc hại (phenol, chloroform) nên cần thận trọng khi thao tác.
• Chiết tách bằng cột silica: Phương pháp nhanh chóng và tiện lợi, dựa trên khả năng liên kết của DNA với silica trong điều kiện nhất định. DNA liên kết với cột silica trong khi các tạp chất khác được rửa trôi. Sau đó, DNA được rửa giải khỏi cột bằng dung dịch đệm thích hợp.
• Chiết tách bằng hạt từ tính: Sử dụng các hạt từ tính được phủ các chất có ái lực với DNA. DNA liên kết với hạt từ tính và được tách ra khỏi dung dịch bằng nam châm. Các tạp chất khác được rửa trôi và DNA sau đó được rửa giải khỏi hạt từ tính.
• Bộ kit chiết tách DNA thương mại: Cung cấp các quy trình tối ưu hóa và tiện lợi cho các loại mẫu khác nhau, giảm thiểu thời gian và công sức chuẩn bị. Các kit này thường sử dụng cột silica hoặc hạt từ tính.

Đánh giá chất lượng DNA

Sau khi chiết tách, chất lượng DNA được đánh giá dựa trên các tiêu chí sau:

• Độ tinh sạch: Đánh giá bằng tỉ lệ hấp thụ quang $A_{260/280}$, lý tưởng là khoảng 1.8 – 2.0. Tỉ lệ này thấp hơn cho thấy có nhiễm protein, còn cao hơn cho thấy có nhiễm RNA. Ngoài ra, tỉ lệ $A_{260/230}$ cũng được sử dụng để đánh giá sự nhiễm bẩn của các chất hữu cơ khác như carbohydrate và phenol. Tỉ lệ này lý tưởng là từ 2.0-2.2.
• Nồng độ: Đo bằng quang phổ UV ở bước sóng 260 nm. Một đơn vị hấp thụ quang (OD) ở bước sóng 260nm tương đương với nồng độ DNA khoảng 50µg/ml.
• Độ nguyên vẹn: Đánh giá bằng điện di trên gel agarose. DNA nguyên vẹn sẽ cho băng rõ ràng, không bị smear (kéo dài, không rõ nét). Sự phân mảnh DNA có thể do quá trình chiết tách hoặc do sự phân hủy DNA trong mẫu.

Chiết tách DNA là một kỹ thuật quan trọng trong sinh học phân tử. Việc lựa chọn phương pháp chiết tách phù hợp và thực hiện đúng quy trình sẽ đảm bảo chất lượng DNA thu được, đáp ứng yêu cầu của các ứng dụng downstream.

Các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu quả chiết tách DNA

Hiệu quả của quá trình chiết tách DNA phụ thuộc vào nhiều yếu tố, bao gồm:

• Loại mẫu: Mỗi loại mẫu (máu, mô, tế bào vi khuẩn, thực vật…) đòi hỏi các phương pháp ly giải tế bào khác nhau. Ví dụ, thành tế bào thực vật cứng hơn tế bào động vật, nên cần xử lý mạnh hơn (như nghiền với nitơ lỏng).
• Độ tươi của mẫu: Mẫu càng tươi thì chất lượng DNA càng cao. Sự phân hủy DNA sau khi sinh vật chết có thể làm giảm hiệu quả chiết tách.
• Phương pháp bảo quản mẫu: Bảo quản mẫu ở nhiệt độ thấp (-20°C hoặc -80°C) giúp ngăn chặn sự phân hủy DNA.
• Các chất ức chế: Một số chất có trong mẫu, ví dụ như heparin trong máu, có thể ức chế hoạt động của enzyme PCR, do đó cần được loại bỏ trong quá trình chiết tách.
• Kỹ thuật thực hiện: Thực hiện chính xác các bước trong quy trình, bao gồm thời gian ủ, nhiệt độ, và lượng hóa chất sử dụng, là rất quan trọng để đạt được hiệu quả chiết tách cao.

Ứng dụng của DNA đã chiết tách

DNA sau khi được chiết tách và tinh sạch có thể được sử dụng trong nhiều ứng dụng khác nhau, ví dụ:

• Phản ứng chuỗi polymerase (PCR): Khuếch đại một đoạn DNA cụ thể để phân tích. PCR được sử dụng rộng rãi trong chẩn đoán bệnh, pháp y, và nghiên cứu sinh học phân tử.
• Southern blotting: Kỹ thuật lai phân tử để phát hiện một đoạn DNA cụ thể trong mẫu. Southern blotting cho phép xác định sự hiện diện, kích thước, và số lượng bản sao của một đoạn DNA cụ thể.
• Xét nghiệm di truyền: Xác định đột biến gen, kiểu gen, quan hệ huyết thống. Chiết tách DNA là bước đầu tiên trong hầu hết các xét nghiệm di truyền.
• Nhân bản gen: Tạo ra nhiều bản sao của một gen cụ thể. Nhân bản gen cho phép nghiên cứu chức năng của gen và sản xuất protein tái tổ hợp.
• Xác định trình tự DNA (DNA sequencing): Xác định thứ tự các nucleotide trong một đoạn DNA. DNA sequencing là công cụ quan trọng trong nghiên cứu genome, phát hiện đột biến, và xác định các loài sinh vật.
• Phân tích biểu hiện gen: Nghiên cứu mức độ biểu hiện của các gen khác nhau trong tế bào. Phân tích biểu hiện gen giúp hiểu rõ hơn về các quá trình sinh học và cơ chế bệnh tật.

Lưu ý an toàn

Một số hóa chất sử dụng trong chiết tách DNA có thể gây hại cho sức khỏe, ví dụ như phenol, chloroform. Cần tuân thủ các quy định an toàn trong phòng thí nghiệm, sử dụng găng tay, kính bảo hộ, và áo choàng khi làm việc với các hóa chất này. Cần xử lý chất thải đúng cách để tránh ô nhiễm môi trường. Cần tham khảo bảng chỉ dẫn an toàn hóa chất (MSDS) cho từng loại hóa chất sử dụng trong quy trình.

• Sambrook, J., Fritsch, E. F., & Maniatis, T. (1989). Molecular cloning: a laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press.
• Ausubel, F. M., Brent, R., Kingston, R. E., Moore, D. D., Seidman, J. G., Smith, J. A., & Struhl, K. (Eds.). (2003). Current protocols in molecular biology. John Wiley & Sons, Inc.
• Wilson, K., & Walker, J. (Eds.). (2018). Principles and techniques of biochemistry and molecular biology. Cambridge university press.

Câu hỏi và Giải đáp

Ngoài phenol-chloroform và cột silica, còn phương pháp chiết tách DNA nào khác đang được sử dụng hiện nay và ưu nhược điểm của chúng là gì?

Trả lời: Một số phương pháp chiết tách DNA khác bao gồm:

• Chiết tách bằng hạt từ tính: Sử dụng hạt từ tính được phủ các chất có ái lực với DNA. Ưu điểm: Nhanh, tự động hóa dễ dàng, ít sử dụng hóa chất độc hại. Nhược điểm: Chi phí có thể cao hơn so với các phương pháp khác.
• Chiết tách dựa trên muối (Salting-out): Sử dụng muối nồng độ cao để kết tủa protein, sau đó tủa DNA bằng cồn. Ưu điểm: Đơn giản, chi phí thấp. Nhược điểm: Hiệu suất chiết tách có thể thấp hơn, dễ nhiễm muối.
• Ly giải kiềm (Alkaline lysis): Thường dùng cho chiết tách plasmid từ vi khuẩn. Ưu điểm: Nhanh, đơn giản. Nhược điểm: DNA thu được thường lẫn RNA.

Làm thế nào để đánh giá độ nguyên vẹn của DNA sau chiết tách ngoài phương pháp điện di trên gel agarose?

Trả lời: Ngoài điện di trên gel agarose, độ nguyên vẹn của DNA có thể được đánh giá bằng các phương pháp sau:

• Phân tích bằng microfluidic: Sử dụng chip microfluidic để phân tích kích thước và phân bố kích thước của DNA.
• Đo độ nhớt: DNA nguyên vẹn có độ nhớt cao hơn DNA bị phân mảnh.
• Phân tích xung trường điện di (PFGE): Phù hợp để phân tích các phân tử DNA lớn.

Ảnh hưởng của việc nhiễm RNA đến các ứng dụng downstream của DNA là gì và làm thế nào để loại bỏ RNA hiệu quả?

Trả lời: Nhiễm RNA có thể ảnh hưởng đến các ứng dụng downstream như PCR, do RNA cũng là một khuôn mẫu cho một số enzyme polymerase. Để loại bỏ RNA hiệu quả, có thể sử dụng:

• RNase A: Enzyme đặc hiệu phân hủy RNA.
• Xử lý bằng DNase-free RNase: Đảm bảo không nhiễm DNase để tránh phân hủy DNA.

Tại sao tỷ lệ A$_{(260/280)}$ được sử dụng để đánh giá độ tinh sạch của DNA và ý nghĩa của các giá trị khác nhau là gì?

Trả lời: Tỷ lệ A$_{(260/280)}$ được sử dụng vì DNA hấp thụ mạnh ánh sáng UV ở bước sóng 260 nm, trong khi protein hấp thụ ở 280 nm. Tỷ lệ lý tưởng là 1.8-2.0.

• A$_{(260/280)}$ < 1.8: Cho thấy mẫu bị nhiễm protein.
• A$_{(260/280)}$ > 2.0: Cho thấy mẫu bị nhiễm RNA.

Làm thế nào để tối ưu hóa quy trình chiết tách DNA từ các mẫu khó, chẳng hạn như mẫu mô đã được cố định bằng formalin và paraffin (FFPE)?

Trả lời: Chiết tách DNA từ mẫu FFPE rất khó khăn do DNA thường bị phân mảnh và liên kết chéo với protein. Để tối ưu hóa quy trình, cần:

• Sử dụng các bộ kit chuyên dụng cho mẫu FFPE: Các bộ kit này thường bao gồm các bước xử lý đặc biệt để đảo ngược liên kết chéo và sửa chữa DNA.
• Tối ưu hóa thời gian và nhiệt độ xử lý: Điều chỉnh các thông số này để tăng hiệu suất chiết tách và giảm thiểu sự phân mảnh DNA.
• Tinh sạch DNA kỹ lưỡng: Loại bỏ triệt để các tạp chất như paraffin và formalin.

Việc tìm hiểu sâu hơn về chiết tách DNA giúp chúng ta lựa chọn phương pháp phù hợp, tối ưu hóa quy trình và đảm bảo chất lượng DNA thu được, phục vụ cho các nghiên cứu và ứng dụng hiệu quả.