Pha tĩnh trong SEC
Pha tĩnh trong SEC là một loại gel xốp, thường được tạo thành từ các hạt polyme hoặc silica có kích thước lỗ rỗng được kiểm soát chặt chẽ. Các lỗ rỗng này hoạt động như một “rây phân tử”. Các phân tử nhỏ có thể đi vào bên trong các lỗ rỗng này, trong khi các phân tử lớn bị loại trừ và di chuyển nhanh hơn qua cột. Kích thước lỗ rỗng của pha tĩnh được lựa chọn cẩn thận để phù hợp với phạm vi kích thước của các phân tử cần tách. Ví dụ, để tách các protein có khối lượng phân tử lớn, người ta sẽ sử dụng gel có kích thước lỗ rỗng lớn. Ngược lại, để tách các peptide nhỏ, người ta sẽ sử dụng gel có kích thước lỗ rỗng nhỏ hơn. Sự lựa chọn đúng loại gel sẽ đảm bảo hiệu quả tách tối ưu.
Cơ chế Tách trong SEC
Quá trình tách trong SEC dựa trên sự phân bố kích thước của các phân tử khi chúng di chuyển qua cột chứa pha tĩnh xốp. Có thể chia thành ba trường hợp:
- Phân tử lớn: Các phân tử có kích thước lớn hơn lỗ rỗng của gel không thể xâm nhập vào bên trong hạt gel. Do đó, chúng bị loại trừ và di chuyển theo dòng dung môi bên ngoài hạt, đi qua cột nhanh nhất.
- Phân tử nhỏ: Các phân tử nhỏ hơn có thể xâm nhập vào bên trong lỗ rỗng của hạt gel. Thời gian lưu của chúng trong cột phụ thuộc vào mức độ chúng có thể xâm nhập vào các lỗ rỗng. Các phân tử càng nhỏ, càng xâm nhập sâu vào các lỗ rỗng và do đó, di chuyển chậm hơn qua cột.
- Phân tử trung bình: Các phân tử có kích thước trung bình sẽ xâm nhập vào một số lỗ rỗng, nhưng không phải tất cả. Thời gian lưu của chúng nằm giữa thời gian lưu của phân tử lớn và phân tử nhỏ.
Kết quả là các phân tử được rửa giải theo thứ tự giảm dần về kích thước: lớn nhất trước, nhỏ nhất sau.
Thể tích Rửa giải ($V_e$)
Thể tích dung môi cần thiết để rửa giải một chất phân tích cụ thể được gọi là thể tích rửa giải ($V_e$). $V_e$ liên quan đến thể tích bên ngoài hạt ($V_0$), thể tích bên trong hạt ($Vi$) và một hằng số $K{SEC}$ biểu thị khả năng xâm nhập của phân tử vào lỗ rỗng:
$V_e = V0 + K{SEC}V_i$
Với:
- $K_{SEC} = 0$: Phân tử bị loại trừ hoàn toàn.
- $0 < K_{SEC} < 1$: Phân tử xâm nhập một phần vào lỗ rỗng.
- $K_{SEC} = 1$: Phân tử xâm nhập hoàn toàn vào lỗ rỗng.
Ứng dụng của SEC
SEC được sử dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực, bao gồm:
- Xác định trọng lượng phân tử: Bằng cách so sánh thể tích rửa giải của một chất chưa biết với thể tích rửa giải của các chất chuẩn có trọng lượng phân tử đã biết, ta có thể ước tính trọng lượng phân tử của chất chưa biết.
- Phân tách các phân tử sinh học: SEC được sử dụng để tách protein, polysaccharide, và các phân tử sinh học khác.
- Tinh sạch protein: SEC có thể được sử dụng để loại bỏ các tạp chất có kích thước khác với protein mong muốn.
- Phân tích polymer: SEC được sử dụng để xác định phân bố trọng lượng phân tử của polymer.
Ưu điểm của SEC
- Tách biệt nhẹ nhàng, ít gây biến tính cho các phân tử sinh học.
- Điều kiện vận hành đơn giản.
- Thời gian phân tích tương đối nhanh.
Nhược điểm của SEC
- Độ phân giải hạn chế so với các kỹ thuật sắc ký khác.
- Khó phân tách các phân tử có kích thước tương tự nhau.
Tóm lại, SEC là một kỹ thuật sắc ký mạnh mẽ và linh hoạt dựa trên sự khác biệt về kích thước của các phân tử để tách chúng, cung cấp một phương pháp đơn giản và hiệu quả cho nhiều ứng dụng khác nhau.
Các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu quả tách chiết trong SEC
Hiệu quả tách chiết trong SEC phụ thuộc vào nhiều yếu tố, bao gồm:
- Kích thước lỗ rỗng của gel: Lựa chọn gel có kích thước lỗ rỗng phù hợp là rất quan trọng để đạt được độ phân giải tốt. Kích thước lỗ rỗng cần được lựa chọn sao cho phù hợp với phạm vi kích thước của các phân tử cần tách.
- Loại gel: Các loại gel khác nhau (ví dụ: dextran, agarose, polyacrylamide) có các đặc tính khác nhau và phù hợp với các ứng dụng khác nhau.
- Lưu lượng dung môi: Lưu lượng dung môi ảnh hưởng đến thời gian phân tích và độ phân giải. Lưu lượng quá nhanh sẽ làm giảm độ phân giải, trong khi lưu lượng quá chậm sẽ kéo dài thời gian phân tích.
- Thể tích mẫu: Thể tích mẫu tiêm vào cột nên nhỏ để tránh làm loãng mẫu và giảm độ phân giải. Thông thường, thể tích mẫu nên nhỏ hơn 2% tổng thể tích cột.
- Dung môi: Dung môi được sử dụng phải hòa tan mẫu và tương thích với pha tĩnh. Dung môi cũng có thể ảnh hưởng đến cấu trúc của các phân tử phân tích, do đó ảnh hưởng đến kích thước hydrodynamic của chúng.
Hiệu chuẩn cột SEC
Để xác định trọng lượng phân tử của các chất chưa biết bằng SEC, cần phải hiệu chuẩn cột bằng các chất chuẩn có trọng lượng phân tử đã biết. Đồ thị thể tích rửa giải ($V_e$) theo logarithm của trọng lượng phân tử (log MW) được xây dựng. Từ đồ thị hiệu chuẩn này, ta có thể xác định trọng lượng phân tử của chất chưa biết dựa trên thể tích rửa giải của nó.
So sánh SEC với các kỹ thuật sắc ký khác
SEC khác biệt so với các kỹ thuật sắc ký khác như sắc ký ái lực, sắc ký trao đổi ion, và sắc ký tương tác kỵ nước ở chỗ nó không dựa trên bất kỳ tương tác hóa học nào giữa chất phân tích và pha tĩnh. Điều này làm cho SEC trở thành một kỹ thuật nhẹ nhàng, phù hợp cho việc tách các phân tử sinh học nhạy cảm.
Các ứng dụng nâng cao của SEC
Ngoài các ứng dụng cơ bản đã đề cập, SEC còn được sử dụng trong một số ứng dụng nâng cao, bao gồm:
- Sắc ký loại trừ kích thước đa chiều (Multidimensional SEC): Kết hợp SEC với các kỹ thuật sắc ký khác để tăng cường độ phân giải.
- Sắc ký loại trừ kích thước trường lưu động (Field-flow fractionation coupled with SEC): Kết hợp SEC với kỹ thuật trường lưu động để phân tách các hạt và phân tử có kích thước rất lớn.