Điện di (Electrophoresis)

Nguyên lý

Khi đặt một điện trường lên một môi trường chứa các phân tử mang điện, các phân tử này sẽ di chuyển về phía cực có điện tích trái dấu. Tốc độ di chuyển (vận tốc điện di) của một phân tử phụ thuộc vào một số yếu tố:

• Điện tích của phân tử: Phân tử mang điện tích càng lớn thì di chuyển càng nhanh. Độ lớn của điện tích ảnh hưởng trực tiếp đến lực điện tác động lên phân tử, lực này tỷ lệ thuận với điện tích.
• Kích thước và hình dạng của phân tử: Phân tử nhỏ và có hình dạng gọn hơn sẽ di chuyển nhanh hơn phân tử lớn và cồng kềnh. Phân tử lớn sẽ chịu lực cản lớn hơn từ môi trường điện di. Hình dạng phân tử cũng ảnh hưởng đến lực cản, ví dụ phân tử hình cầu sẽ di chuyển nhanh hơn phân tử hình sợi có cùng khối lượng.
• Cường độ điện trường: Điện trường càng mạnh, phân tử di chuyển càng nhanh. Cường độ điện trường cao tạo ra lực điện lớn hơn, đẩy nhanh tốc độ di chuyển của phân tử.
• Tính chất của môi trường điện di: Độ nhớt và các tính chất khác của môi trường (như gel agarose hoặc polyacrylamide) ảnh hưởng đến tốc độ di chuyển của phân tử. Môi trường nhớt hơn sẽ cản trở sự di chuyển của phân tử. Nồng độ của gel cũng ảnh hưởng đến khả năng phân tách các phân tử có kích thước khác nhau. Gel nồng độ cao sẽ phù hợp để phân tách các phân tử nhỏ, trong khi gel nồng độ thấp phù hợp cho phân tử lớn.

Công thức cơ bản

Vận tốc điện di ($v$) của một phân tử được tính theo công thức:

$v = \frac{Eq}{f}$

Trong đó:

• $v$: Vận tốc điện di
• $E$: Cường độ điện trường
• $q$: Điện tích của phân tử
• $f$: Hệ số ma sát, phụ thuộc vào kích thước và hình dạng của phân tử cũng như độ nhớt của môi trường. Hệ số ma sát thể hiện lực cản của môi trường tác động lên phân tử khi di chuyển.

Các loại điện di phổ biến

• Điện di trên gel agarose: Thường dùng để phân tách các phân tử DNA và RNA. Gel agarose có cấu trúc xốp, cho phép các phân tử nhỏ di chuyển nhanh hơn các phân tử lớn. Kích thước lỗ trên gel agarose tương đối lớn, phù hợp cho phân tách các phân tử có kích thước từ vài trăm đến vài triệu base pairs.
• Điện di trên gel polyacrylamide (PAGE): Cung cấp độ phân giải cao hơn so với gel agarose, thường dùng để phân tách protein và các phân tử nhỏ khác. Có thể sử dụng PAGE trong điều kiện biến tính (SDS-PAGE) để phân tách protein dựa trên khối lượng phân tử. Kích thước lỗ trên gel polyacrylamide nhỏ hơn, cho phép phân tách các phân tử có kích thước nhỏ và chênh lệch khối lượng nhỏ. SDS (Sodium dodecyl sulfate) là một chất tẩy rửa giúp làm biến tính và phủ điện tích âm lên protein, giúp protein di chuyển theo kích thước trong điện trường.
• Điện di mao quản (CE): Kỹ thuật này sử dụng mao quản hẹp chứa dung dịch điện di để phân tách các phân tử. CE có tốc độ phân tích nhanh và độ phân giải cao. Mao quản có đường kính rất nhỏ, giảm thiểu sự khuếch tán của phân tử, dẫn đến độ phân giải cao.
• Điện di đẳng điện (IEF): Phân tách các phân tử dựa trên điểm đẳng điện của chúng (pI), là pH mà tại đó phân tử không mang điện tích. Kỹ thuật này sử dụng một gradient pH trong gel. Phân tử sẽ di chuyển đến vị trí có pH bằng với điểm đẳng điện của nó, tại đó điện tích của phân tử bằng không.

Ứng dụng

Điện di có nhiều ứng dụng trong các lĩnh vực khác nhau, bao gồm:

• Sinh học phân tử: Phân tích DNA, RNA và protein, xác định kích thước và độ tinh khiết của các phân tử này.
• Y học: Chẩn đoán bệnh, phân tích protein huyết thanh, xác định kiểu gen.
• Khoa học pháp y: Xác định DNA trong các mẫu vật từ hiện trường vụ án.
• Công nghệ sinh học: Tinh sạch protein, nghiên cứu tương tác protein-protein.

Ưu điểm của kỹ thuật điện di

• Tương đối đơn giản và dễ thực hiện: Quy trình điện di cơ bản không quá phức tạp và có thể được thực hiện với các thiết bị tương đối đơn giản.
• Chi phí thấp: So với nhiều kỹ thuật phân tích khác, điện di có chi phí vận hành và thiết bị thấp hơn.
• Có thể phân tích nhiều loại phân tử khác nhau: Điện di có thể được sử dụng để phân tách nhiều loại phân tử, từ các phân tử nhỏ như axit amin đến các phân tử lớn như DNA và protein.
• Độ nhạy và độ phân giải cao: Điện di có thể phân tách các phân tử có kích thước và điện tích rất gần nhau, cho phép độ phân giải cao. Độ nhạy của kỹ thuật cũng cao, có thể phát hiện lượng nhỏ phân tử.

Nhược điểm

• Có thể xảy ra hiện tượng khuếch tán của các phân tử, làm giảm độ phân giải: Trong quá trình điện di, các phân tử có thể khuếch tán, làm mờ các băng và giảm độ phân giải. Điều này đặc biệt đúng với thời gian điện di dài.
• Một số loại điện di yêu cầu thiết bị chuyên dụng: Một số kỹ thuật điện di tiên tiến, chẳng hạn như CE và 2DE, yêu cầu thiết bị chuyên dụng và đắt tiền.
• Kết quả có thể bị ảnh hưởng bởi các yếu tố như nhiệt độ và pH: Nhiệt độ và pH có thể ảnh hưởng đến tính chất của gel và điện tích của phân tử, do đó ảnh hưởng đến kết quả điện di.

Các yếu tố ảnh hưởng đến điện di

Một số yếu tố quan trọng cần xem xét khi thực hiện điện di bao gồm:

• Nồng độ gel: Nồng độ gel ảnh hưởng đến kích thước lỗ gel, do đó ảnh hưởng đến tốc độ di chuyển của các phân tử. Gel đậm đặc hơn phù hợp cho phân tách các phân tử nhỏ, trong khi gel loãng hơn thích hợp cho các phân tử lớn.
• Điện áp: Điện áp cao hơn sẽ làm tăng tốc độ di chuyển, nhưng cũng có thể tạo ra nhiệt, làm biến tính mẫu. Cần lựa chọn điện áp phù hợp để tối ưu hóa tốc độ di chuyển và tránh hư hỏng mẫu.
• Nhiệt độ: Nhiệt độ cao có thể làm biến tính mẫu và ảnh hưởng đến tính chất của gel. Điện di thường được thực hiện ở nhiệt độ thấp để tránh những vấn đề này. Nhiệt độ thấp cũng giúp giảm sự khuếch tán của phân tử.
• Dung dịch đệm: Thành phần và pH của dung dịch đệm ảnh hưởng đến điện tích của phân tử và tính chất của gel. Việc lựa chọn dung dịch đệm phù hợp rất quan trọng để đảm bảo kết quả điện di chính xác. Dung dịch đệm giúp duy trì pH ổn định trong quá trình điện di.
• Thời gian điện di: Thời gian điện di cần đủ để phân tách các phân tử, nhưng không quá lâu để tránh hiện tượng khuếch tán.

Một số kỹ thuật điện di đặc biệt

Ngoài các kỹ thuật điện di phổ biến đã được đề cập, còn một số kỹ thuật chuyên biệt khác, ví dụ:

• Điện di hai chiều (2DE): Kết hợp IEF và SDS-PAGE để phân tách protein dựa trên cả điểm đẳng điện và khối lượng phân tử, cung cấp độ phân giải rất cao.
• Điện di pulsed-field (PFGE): Sử dụng điện trường thay đổi hướng để phân tách các phân tử DNA rất lớn.

Chuẩn bị mẫu và phân tích kết quả

Việc chuẩn bị mẫu đúng cách rất quan trọng để đảm bảo kết quả điện di chính xác. Sau khi điện di, các phân tử được hiển thị bằng cách nhuộm với các chất nhuộm đặc hiệu. Ví dụ, Ethidium bromide thường được sử dụng để nhuộm DNA và RNA, trong khi Coomassie Brilliant Blue được sử dụng để nhuộm protein. Kết quả điện di có thể được phân tích bằng mắt thường hoặc bằng các thiết bị chuyên dụng để định lượng và xác định kích thước của các phân tử. Các thiết bị chuyên dụng, ví dụ như máy chụp ảnh gel, có thể phân tích cường độ băng và tính toán kích thước phân tử dựa trên thang chuẩn.

• Sambrook, J., & Russell, D. W. (2001). Molecular cloning: a laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press.
• Wilson, K., & Walker, J. (2018). Principles and techniques of biochemistry and biophysics. Cambridge University Press.
• Alberts, B., Johnson, A., Lewis, J., Raff, M., Roberts, K., & Walter, P. (2002). Molecular biology of the cell. Garland Science.

Câu hỏi và Giải đáp

Tại sao việc lựa chọn dung dịch đệm lại quan trọng trong điện di?

Trả lời: Dung dịch đệm đóng vai trò quan trọng trong điện di vì nó ảnh hưởng đến điện tích của phân tử và duy trì pH ổn định trong quá trình điện di. pH của dung dịch đệm ảnh hưởng đến sự ion hóa của phân tử, do đó ảnh hưởng đến điện tích và tốc độ di chuyển của chúng. Một dung dịch đệm không phù hợp có thể dẫn đến sự biến tính của mẫu hoặc kết quả điện di không chính xác.

Làm thế nào để xác định kích thước của một phân tử DNA sau khi điện di trên gel agarose?

Trả lời: Kích thước của phân tử DNA sau điện di trên gel agarose được xác định bằng cách so sánh khoảng cách di chuyển của nó với khoảng cách di chuyển của các đoạn DNA chuẩn có kích thước đã biết (DNA marker). Một đường cong chuẩn được vẽ bằng cách biểu diễn logarit của kích thước các đoạn DNA chuẩn theo khoảng cách di chuyển của chúng. Từ đó, có thể suy ra kích thước của phân tử DNA chưa biết dựa trên khoảng cách di chuyển của nó trên gel.

Sự khác biệt chính giữa điện di trên gel agarose và PAGE là gì? Khi nào nên sử dụng từng loại?

Trả lời: Sự khác biệt chính nằm ở kích thước lỗ gel và độ phân giải. Gel agarose có lỗ gel lớn hơn, phù hợp cho phân tách các phân tử DNA và RNA lớn. PAGE có lỗ gel nhỏ hơn, cung cấp độ phân giải cao hơn, phù hợp cho phân tách protein và các phân tử nhỏ khác.

Giải thích nguyên lý của SDS-PAGE? Tại sao SDS lại cần thiết trong kỹ thuật này?

Trả lời: SDS-PAGE là một kỹ thuật điện di sử dụng Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) để biến tính protein. SDS là một chất tẩy rửa anion, nó liên kết với protein và làm cho chúng mang điện tích âm tỷ lệ với khối lượng phân tử. Điều này giúp loại bỏ ảnh hưởng của điện tích và hình dạng ban đầu của protein, cho phép phân tách protein dựa trên khối lượng phân tử.

Điện di đẳng điện (IEF) khác với các kỹ thuật điện di khác như thế nào?

Trả lời: IEF phân tách các phân tử dựa trên điểm đẳng điện (pI) của chúng. Trong IEF, một gradient pH được thiết lập trên gel. Các phân tử sẽ di chuyển trong điện trường cho đến khi chúng đạt đến vùng có pH bằng với pI của chúng, tại đó chúng không còn mang điện tích và dừng di chuyển. Điều này khác với các kỹ thuật điện di khác, nơi phân tách dựa trên kích thước và điện tích trong một dung dịch đệm có pH cố định.