Điện di mao quản (Capillary electrophoresis (CE))

Nguyên lý hoạt động

CE dựa trên nguyên lý di chuyển điện động, trong đó các phân tử tích điện di chuyển trong một điện trường. Tốc độ di chuyển của một phân tử được xác định bởi hai yếu tố chính: điện tích của phân tử và kích thước/hình dạng của phân tử. Phân tử tích điện dương sẽ di chuyển về phía cực âm (cathode) và phân tử tích điện âm sẽ di chuyển về phía cực dương (anode). Điện tích càng lớn, tốc độ di chuyển càng nhanh. Đồng thời, phân tử nhỏ và gọn di chuyển nhanh hơn phân tử lớn và cồng kềnh do ma sát với dung dịch đệm và thành mao quản.

Trong mao quản chứa đầy dung dịch đệm, một hiện tượng quan trọng gọi là dòng điện động học (electroosmotic flow – EOF) xảy ra. EOF là sự di chuyển của toàn bộ dung dịch đệm về phía cathode do sự tích điện âm của thành mao quản (thường làm bằng silica). EOF đóng vai trò như một “băng chuyền” mang tất cả các phân tử, kể cả các phân tử trung hòa, về phía detector. Điều này cho phép tất cả các analyte, bất kể điện tích, cuối cùng đi qua detector để phát hiện.

Tốc độ di chuyển biểu kiến (v) của một phân tử trong CE được tính bằng tổng của vận tốc di chuyển điện động ($v{ep}$) và vận tốc của dòng điện động học ($v{eof}$):

$v = v{ep} + v{eof}$

Các thành phần của hệ thống CE

Một hệ thống CE điển hình bao gồm các thành phần chính sau:

• Mao quản: Một ống silica nóng chảy có đường kính trong nhỏ (thường từ 25 đến 75 μm) và chiều dài từ 20 đến 100 cm. Thành mao quản thường được phủ một lớp để điều chỉnh tính chất bề mặt.
• Nguồn điện áp cao: Cung cấp điện trường cần thiết cho sự phân tách (thường từ 10 đến 30 kV). Điện áp cao này tạo ra lực đẩy các phân tử tích điện dọc theo mao quản.
• Hai bình chứa dung dịch đệm (vials): Một vial chứa anode và một vial chứa cathode, được nối với mao quản. Dung dịch đệm giúp duy trì pH ổn định và dẫn điện.
• Detector: Phát hiện các phân tử khi chúng đi qua cửa sổ phát hiện trên mao quản. Các loại detector phổ biến bao gồm detector UV-Vis, detector huỳnh quang và detector khối phổ. Sự lựa chọn detector phụ thuộc vào tính chất của analyte.
• Hệ thống tiêm mẫu: Đưa mẫu vào mao quản. Các phương pháp tiêm mẫu phổ biến bao gồm tiêm thủy tĩnh và tiêm điện động. Thể tích tiêm thường rất nhỏ, chỉ vài nanolít.
• Hệ thống thu thập và xử lý dữ liệu: Ghi lại tín hiệu detector và chuyển đổi thành electropherogram, biểu diễn sự phụ thuộc của tín hiệu detector theo thời gian. Electropherogram cho phép định tính và định lượng các thành phần trong mẫu.

Ưu điểm của CE

• Hiệu quả phân tách cao: CE có thể phân tách các phân tử có sự khác biệt rất nhỏ về điện tích hoặc kích thước.
• Thời gian phân tích nhanh: Thời gian phân tích thường chỉ vài phút.
• Tiêu tốn mẫu ít: Chỉ cần một lượng mẫu rất nhỏ (nanolít) cho mỗi lần phân tích.
• Linh hoạt trong việc lựa chọn dung dịch đệm và điều kiện phân tách: Điều này cho phép tối ưu hóa quá trình phân tách cho các loại mẫu khác nhau.

Nhược điểm của CE

• Độ nhạy thấp hơn so với một số kỹ thuật phân tách khác như sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC): Điều này có thể hạn chế việc ứng dụng CE cho các mẫu có nồng độ thấp.
• Khó định lượng do thể tích tiêm mẫu nhỏ: Độ chính xác của định lượng có thể bị ảnh hưởng bởi sự biến đổi trong quá trình tiêm mẫu.
• Dễ bị ảnh hưởng bởi các yếu tố môi trường như nhiệt độ và độ pH: Cần kiểm soát cẩn thận các yếu tố này để đảm bảo tính lặp lại của kết quả phân tích.

Ứng dụng của CE

CE được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực, bao gồm:

• Phân tích các ion vô cơ và hữu cơ: CE có thể phân tách và định lượng các ion khác nhau trong các mẫu môi trường, thực phẩm và dược phẩm.
• Phân tích protein, peptide và axit nucleic: CE là một công cụ mạnh mẽ để nghiên cứu cấu trúc và chức năng của các phân tử sinh học này.
• Phân tích carbohydrate và các phân tử nhỏ khác: CE có thể được sử dụng để phân tích các loại đường, vitamin và các chất chuyển hóa khác.
• Kiểm tra độ tinh khiết của dược phẩm: CE được sử dụng để kiểm tra sự hiện diện của các tạp chất trong các sản phẩm dược phẩm.
• Phân tích mẫu sinh học và môi trường: CE có thể được sử dụng để phân tích các mẫu nước, đất và không khí để phát hiện các chất ô nhiễm.

Các kiểu điện di mao quản (CE)

CE bao gồm nhiều kiểu khác nhau, mỗi kiểu được tối ưu hóa cho các ứng dụng cụ thể:

• Điện di mao quản vùng (CZE): Kiểu CE phổ biến nhất, dựa trên sự khác biệt về tỉ lệ điện tích/khối lượng của các chất phân tích. CZE thích hợp cho việc phân tách các ion nhỏ, peptide và protein.
• Điện di mao quản gel (CGE): Sử dụng gel polymer bên trong mao quản để phân tách các phân tử dựa trên kích thước. CGE thường được sử dụng để phân tích protein, DNA và RNA.
• Điện di mao quản micelle (MEKC): Sử dụng micelle (tập hợp các phân tử surfactant) để phân tách các chất phân tích dựa trên tính kỵ nước. MEKC cho phép phân tách cả các chất tích điện và không tích điện.
• Điện di mao quản đẳng điện điểm (IEF): Phân tách các phân tử lưỡng tính (ampholyte) dựa trên điểm đẳng điện của chúng. IEF thường được sử dụng để phân tích protein.

Các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu quả phân tách trong CE

Hiệu quả phân tách trong CE phụ thuộc vào nhiều yếu tố, bao gồm:

• Điện áp: Điện áp cao hơn thường dẫn đến thời gian phân tích nhanh hơn nhưng cũng có thể làm tăng sự khuếch tán và giảm hiệu quả phân tách.
• Dung dịch đệm: Thành phần, pH và nồng độ của dung dịch đệm ảnh hưởng đến điện tích của các chất phân tích và EOF.
• Nhiệt độ: Nhiệt độ cao có thể làm tăng sự khuếch tán và giảm hiệu quả phân tách. Việc kiểm soát nhiệt độ là quan trọng để đảm bảo tính lặp lại của kết quả.
• Đường kính trong và chiều dài mao quản: Mao quản có đường kính trong nhỏ hơn và chiều dài lớn hơn thường cho hiệu quả phân tách cao hơn nhưng cũng làm tăng thời gian phân tích.
• Phương pháp tiêm mẫu: Thể tích tiêm mẫu ảnh hưởng đến độ nhạy và độ phân giải của phân tách.

Kết hợp CE với các kỹ thuật khác

CE có thể được kết hợp với các kỹ thuật phân tích khác như khối phổ (MS) để tăng cường khả năng xác định và định lượng các chất phân tích. Sự kết hợp CE-MS mang lại thông tin về cả thời gian di chuyển và khối lượng phân tử của các chất phân tích, giúp phân tích các mẫu phức tạp.

Phát triển gần đây trong CE

Nghiên cứu và phát triển trong CE tập trung vào việc cải thiện hiệu quả phân tách, độ nhạy và tính ứng dụng. Một số hướng phát triển gần đây bao gồm:

• Sử dụng mao quản có lớp phủ bề mặt mới để giảm sự hấp phụ của các chất phân tích và cải thiện EOF. Các loại lớp phủ này có thể làm giảm sự tương tác không mong muốn giữa analyte và thành mao quản.
• Phát triển các detector mới có độ nhạy cao hơn. Điều này cho phép phân tích các mẫu có nồng độ thấp hơn.
• Ứng dụng CE trong các lĩnh vực mới như phân tích đơn tế bào và phân tích tại chỗ (in situ analysis). Những ứng dụng này mở ra những khả năng mới cho việc nghiên cứu các hệ thống sinh học phức tạp.

• Landers, J. P. (Ed.). (2013). Handbook of capillary electrophoresis. CRC press.
• Camilleri, P. (Ed.). (1998). Capillary electrophoresis: Theory and practice. CRC press.
• Wehr, T., Rodriguez-Diaz, R., & Zhu, M. (1998). Capillary Electrophoresis of Proteins. Marcel Dekker.
• Baker, D. R. (1995). Capillary Electrophoresis. John Wiley & Sons.

Câu hỏi và Giải đáp

Làm thế nào để tối ưu hóa điều kiện phân tách trong CE để đạt được hiệu quả phân tách cao nhất cho một hỗn hợp peptide phức tạp?

Trả lời: Việc tối ưu hóa điều kiện phân tách trong CE cho hỗn hợp peptide phức tạp cần xem xét nhiều yếu tố. Đầu tiên, cần lựa chọn dung dịch đệm phù hợp, bao gồm pH, nồng độ và các chất phụ gia. pH ảnh hưởng đến điện tích của peptide, trong khi nồng độ dung dịch đệm ảnh hưởng đến cường độ dòng điện và EOF. Tiếp theo, điện áp cần được điều chỉnh để cân bằng giữa thời gian phân tách và hiệu quả phân tách. Điện áp cao hơn dẫn đến thời gian phân tách nhanh hơn nhưng có thể làm giảm độ phân giải. Nhiệt độ cũng cần được kiểm soát chặt chẽ để giảm thiểu sự khuếch tán. Cuối cùng, việc lựa chọn loại mao quản (ví dụ như đường kính trong và chiều dài) và phương pháp tiêm mẫu cũng cần được tối ưu hóa để đạt được hiệu quả phân tách tốt nhất. Có thể sử dụng các phương pháp thiết kế thí nghiệm để tối ưu hóa đồng thời nhiều yếu tố.

Sự khác biệt chính giữa CZE và MEKC là gì và khi nào nên sử dụng từng kỹ thuật?

Trả lời: Cả CZE và MEKC đều là các kiểu CE, nhưng chúng khác nhau về cơ chế phân tách. CZE phân tách các chất phân tích dựa trên tỉ lệ điện tích/khối lượng của chúng. MEKC sử dụng micelle, là các tập hợp của các phân tử surfactant, để tạo ra một pha giả tĩnh. Các chất phân tích được phân tách dựa trên sự phân bố của chúng giữa pha micelle và dung dịch đệm. Nên sử dụng CZE cho việc phân tách các phân tử tích điện, đặc biệt là các ion nhỏ, peptide và protein. MEKC thích hợp cho việc phân tách cả các chất tích điện và không tích điện, đặc biệt là các chất có tính kỵ nước khác nhau.

EOF là gì và nó đóng vai trò như thế nào trong CE?

Trả lời: EOF (Electroosmotic Flow) là dòng chảy của dung dịch đệm trong mao quản dưới tác dụng của điện trường. EOF xảy ra do sự tích điện âm của thành mao quản (thường làm bằng silica). Các ion dương trong dung dịch đệm bị hút về phía cathode, kéo theo toàn bộ dung dịch đệm di chuyển theo. EOF đóng vai trò quan trọng trong CE vì nó giúp vận chuyển tất cả các chất phân tích, kể cả các chất trung hòa, về phía đầu dò. Tốc độ của EOF ảnh hưởng đến thời gian phân tách và có thể được điều chỉnh bằng cách thay đổi pH và nồng độ của dung dịch đệm.

Tại sao CE lại được coi là một kỹ thuật phân tách có hiệu quả cao?

Trả lời: CE được coi là một kỹ thuật phân tách có hiệu quả cao do khả năng tạo ra các peak hẹp và sắc nét trên electropherogram. Điều này đạt được nhờ hiệu ứng khuếch tán nhỏ trong mao quản hẹp và sự đồng nhất của dòng chảy EOF. Không giống như sắc ký lỏng, CE không sử dụng pha tĩnh đóng gói, do đó giảm thiểu sự phân tán Eddy và sự phân tán do dòng chảy nhiều đường. Kết quả là CE có thể đạt được số đĩa lý thuyết rất cao, cho phép phân tách các chất có tính chất rất giống nhau.

Những hạn chế chính của CE là gì và làm thế nào để khắc phục chúng?

Trả lời: Một số hạn chế của CE bao gồm độ nhạy thấp so với một số kỹ thuật phân tách khác và khó khăn trong việc định lượng do thể tích tiêm mẫu nhỏ. Để khắc phục hạn chế về độ nhạy, có thể sử dụng các detector có độ nhạy cao hơn hoặc áp dụng các kỹ thuật tiền xử lý mẫu để làm giàu chất phân tích. Đối với vấn đề định lượng, có thể sử dụng các phương pháp chuẩn nội hoặc chuẩn ngoại để hiệu chỉnh thể tích tiêm mẫu. Một hạn chế khác là CE dễ bị ảnh hưởng bởi sự hấp phụ của các chất phân tích lên thành mao quản. Điều này có thể được khắc phục bằng cách sử dụng mao quản có lớp phủ bề mặt hoặc bằng cách tối ưu hóa dung dịch đệm để giảm thiểu sự hấp phụ.