Điện di trên gel agarose (Agarose gel electrophoresis)

Nguyên lý

Nguyên lý của điện di trên gel agarose dựa trên sự di chuyển của các phân tử tích điện dưới tác động của điện trường. DNA và RNA mang điện tích âm do sự hiện diện của nhóm phosphate trong cấu trúc của chúng. Khi đặt vào điện trường, các phân tử này sẽ di chuyển từ cực âm sang cực dương. Gel agarose hoạt động như một “rây phân tử”, trong đó các phân tử nhỏ hơn sẽ di chuyển nhanh hơn và xa hơn trong gel so với các phân tử lớn hơn. Kích thước lỗ của ma trận gel agarose có thể được điều chỉnh bằng cách thay đổi nồng độ agarose. Nồng độ agarose càng cao, kích thước lỗ càng nhỏ, phù hợp để phân tách các phân tử DNA/RNA có kích thước nhỏ. Ngược lại, nồng độ agarose thấp tạo ra kích thước lỗ lớn, thích hợp cho việc phân tách các phân tử DNA/RNA lớn. Ngoài kích thước, hình dạng của phân tử cũng ảnh hưởng đến tốc độ di chuyển. Ví dụ, phân tử DNA mạch vòng siêu xoắn di chuyển nhanh hơn dạng mạch vòng mở có cùng kích thước.

Các yếu tố ảnh hưởng đến tốc độ di chuyển

Một số yếu tố ảnh hưởng đến tốc độ di chuyển của các phân tử trong điện di trên gel agarose bao gồm:

• Kích thước phân tử: Đây là yếu tố quan trọng nhất. Phân tử nhỏ di chuyển nhanh hơn phân tử lớn.
• Nồng độ agarose: Nồng độ agarose cao tạo ra ma trận gel dày đặc hơn, cản trở sự di chuyển của các phân tử, đặc biệt là các phân tử lớn. Ngược lại, nồng độ thấp cho phép phân tách các phân tử lớn hiệu quả hơn.
• Điện trường: Điện áp cao hơn dẫn đến tốc độ di chuyển nhanh hơn, nhưng có thể làm nóng gel và ảnh hưởng đến kết quả. Việc lựa chọn điện áp phù hợp phụ thuộc vào kích thước của gel và loại dung dịch đệm sử dụng.
• Thành phần dung dịch đệm: Dung dịch đệm duy trì pH ổn định và cung cấp các ion cần thiết cho quá trình điện di. Các dung dịch đệm thường được sử dụng là TAE (Tris-acetate-EDTA) và TBE (Tris-borate-EDTA). TBE có khả năng đệm tốt hơn TAE, nhưng có thể gây khó khăn cho các bước tiếp theo như tinh sạch DNA.
• Hình dạng phân tử: Phân tử dạng thẳng di chuyển nhanh hơn phân tử dạng vòng hoặc cuộn xoắn cùng kích thước.

Quy trình thực hiện

Quy trình thực hiện điện di trên gel agarose bao gồm các bước sau:

1. Chuẩn bị gel agarose: Agarose được hòa tan trong dung dịch đệm (thường là TAE hoặc TBE) và đun nóng cho đến khi tan hoàn toàn. Cần khuấy đều để đảm bảo agarose phân bố đồng nhất.
2. Đổ gel: Dung dịch agarose nóng được đổ vào khuôn có lược để tạo giếng chứa mẫu. Cần đảm bảo không có bọt khí trong gel.
3. Chuẩn bị mẫu: Mẫu DNA, RNA, hoặc protein được trộn với dung dịch tải mẫu (loading dye) chứa chất tạo màu (thường là xylene cyanol và bromophenol blue) và glycerol để tăng mật độ giúp mẫu lắng xuống giếng. Dung dịch tải mẫu cũng giúp theo dõi quá trình điện di.
4. Chạy điện di: Gel được đặt trong bể điện di chứa dung dịch đệm. Điện trường được áp dụng và duy trì trong một khoảng thời gian nhất định. Cần đảm bảo cực âm của bể điện di nằm gần giếng chứa mẫu.
5. Nhuộm và quan sát: Sau khi điện di, gel được nhuộm bằng chất nhuộm đặc hiệu (ví dụ: ethidium bromide cho DNA) để quan sát các băng DNA dưới ánh sáng UV. Các chất nhuộm khác như SYBR Green I cũng thường được sử dụng.

Ứng dụng

Điện di trên gel agarose có nhiều ứng dụng trong sinh học phân tử, bao gồm:

• Phân tách và xác định kích thước DNA/RNA: Bằng cách so sánh với thang chuẩn DNA (DNA ladder) có kích thước đã biết.
• Phân tích sản phẩm PCR: Kiểm tra sự hiện diện và kích thước của sản phẩm PCR.
• Tinh sạch DNA: Tách chiết các đoạn DNA mong muốn từ gel.
• Southern blotting và Northern blotting: Chuyển DNA hoặc RNA từ gel lên màng để lai phân tử.

Ưu điểm

Điện di trên gel agarose có nhiều ưu điểm, bao gồm:

• Đơn giản, dễ thực hiện: Quy trình thực hiện tương đối đơn giản và không yêu cầu thiết bị phức tạp.
• Chi phí thấp: Agarose và các hóa chất sử dụng có giá thành rẻ.
• Độ phân giải tốt: Có thể phân tách các đoạn DNA/RNA có kích thước khác nhau hiệu quả.

Nhược điểm

Tuy nhiên, phương pháp này cũng có một số nhược điểm:

• Độ phân giải hạn chế đối với các phân tử có kích thước rất gần nhau: Khó phân biệt các đoạn DNA/RNA có kích thước chênh lệch nhỏ.
• Gel agarose có thể bị vỡ: Cần thao tác cẩn thận khi xử lý gel.

Công thức (ví dụ tính toán nồng độ agarose)

Để chuẩn bị gel agarose với nồng độ mong muốn, ta có thể sử dụng công thức sau:

C% = (m_{chất tan} / m_{dung dịch}) x 100%

Trong đó:

• C%: Nồng độ phần trăm (%)
• m_{chất tan}: Khối lượng chất tan (g) (ở đây là agarose)
• m_{dung dịch}: Khối lượng dung dịch (g) (giả sử khối lượng riêng dung dịch xấp xỉ nước là 1g/ml)

Ví dụ: Nếu muốn chuẩn bị gel agarose 1%, ta cần 1g agarose cho 100ml dung dịch đệm.

Các loại gel agarose

Có nhiều loại agarose khác nhau được sử dụng cho điện di, mỗi loại có đặc tính riêng biệt phù hợp với các ứng dụng cụ thể. Một số loại agarose phổ biến bao gồm:

• Agarose tiêu chuẩn: Thường được sử dụng cho phân tách các đoạn DNA có kích thước từ 500 bp đến 20 kb.
• Agarose phân giải thấp (Low-melting point agarose): Có điểm nóng chảy thấp, thích hợp cho việc tách chiết DNA sau điện di.
• Agarose phân giải cao (High-resolution agarose): Cho phép phân tách các đoạn DNA có kích thước nhỏ, chênh lệch vài bp.

Lựa chọn dung dịch đệm

Hai loại dung dịch đệm phổ biến nhất được sử dụng trong điện di trên gel agarose là TAE (Tris-acetate-EDTA) và TBE (Tris-borate-EDTA).

• TAE: Có khả năng đệm thấp hơn TBE, nhưng cho phép DNA di chuyển nhanh hơn. Thích hợp cho việc phân tách các đoạn DNA lớn và điện di trong thời gian ngắn.
• TBE: Có khả năng đệm cao hơn, phù hợp cho việc chạy điện di trong thời gian dài. Tuy nhiên, borate trong TBE có thể ức chế một số enzyme, cần lưu ý khi muốn tinh sạch DNA sau điện di.

Các vấn đề thường gặp và cách khắc phục

Một số vấn đề thường gặp khi thực hiện điện di trên gel agarose và cách khắc phục:

• Gel bị mờ: Có thể do nồng độ agarose quá thấp hoặc dung dịch đệm không phù hợp. Nên tăng nồng độ agarose hoặc sử dụng dung dịch đệm mới.
• Băng DNA bị méo: Có thể do điện trường không đều hoặc gel bị quá tải mẫu. Kiểm tra lại vị trí đặt điện cực và giảm lượng mẫu DNA.
• Không thấy băng DNA: Có thể do DNA bị phân hủy, chất nhuộm không hoạt động hoặc điện di không đúng cách. Kiểm tra chất lượng DNA, chất nhuộm và quy trình điện di.

Một số kỹ thuật liên quan

• Điện di trường xung (Pulsed-field gel electrophoresis – PFGE): Cho phép phân tách các đoạn DNA rất lớn, lên đến hàng triệu bp.
• Điện di mao quản (Capillary electrophoresis): Một phương pháp điện di tự động, sử dụng mao quản chứa gel thay cho gel agarose phẳng.

An toàn khi sử dụng ethidium bromide

Ethidium bromide là một chất nhuộm huỳnh quang phổ biến được sử dụng để quan sát DNA trên gel agarose. Tuy nhiên, đây là một chất có khả năng gây đột biến. Cần thận trọng khi sử dụng và tuân thủ các quy định an toàn. Nên sử dụng găng tay và kính bảo hộ khi thao tác với ethidium bromide. Hiện nay, có nhiều chất nhuộm an toàn hơn đang được sử dụng thay thế cho ethidium bromide, ví dụ như SYBR Green I.

Xu hướng phát triển

Các kỹ thuật điện di mới đang được phát triển, bao gồm việc sử dụng các chất nhuộm an toàn hơn thay thế ethidium bromide và các hệ thống điện di tự động.

• Sambrook, J., Fritsch, E. F., & Maniatis, T. (1989). Molecular cloning: a laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press.
• Alberts, B., Johnson, A., Lewis, J., Raff, M., Roberts, K., & Walter, P. (2004). Molecular biology of the cell. Garland Science.
• Lodish, H., Berk, A., Zipursky, S. L., Matsudaira, P., Baltimore, D., & Darnell, J. (2000). Molecular cell biology. W. H. Freeman.

Câu hỏi và Giải đáp

Tại sao ta không thể sử dụng nước cất thay cho dung dịch đệm trong điện di trên gel agarose?

Trả lời: Nước cất không có khả năng đệm, nghĩa là pH của nó có thể thay đổi dễ dàng. Trong điện di, quá trình này tạo ra ion H+ và OH-. Nếu không có dung dịch đệm, pH sẽ thay đổi đáng kể, ảnh hưởng đến điện tích của DNA và do đó ảnh hưởng đến sự di chuyển của DNA trong gel. Dung dịch đệm cũng cung cấp các ion cần thiết để duy trì dòng điện chạy qua gel.

Làm thế nào để lựa chọn nồng độ agarose phù hợp cho việc phân tách các đoạn DNA có kích thước khác nhau?

Trả lời: Nồng độ agarose ảnh hưởng đến kích thước lỗ rỗng trong gel. Nồng độ agarose càng cao, lỗ rỗng càng nhỏ, phù hợp để phân tách các đoạn DNA nhỏ. Ngược lại, nồng độ agarose thấp tạo ra lỗ rỗng lớn hơn, phù hợp cho các đoạn DNA lớn. Ví dụ:

• 0.5% – 1% agarose: phân tách DNA kích thước lớn (5-20 kb)
• 1% – 1.5% agarose: phân tách DNA kích thước trung bình (0.5-7 kb)
• 1.5% – 2% agarose: phân tách DNA kích thước nhỏ (0.2-3 kb)

Ngoài ethidium bromide, còn có những chất nhuộm nào khác có thể được sử dụng để quan sát DNA trên gel agarose? Ưu điểm của chúng là gì?

Trả lời: Một số chất nhuộm thay thế ethidium bromide bao gồm SYBR Green, GelRed, và EvaGreen. Ưu điểm của các chất nhuộm này là chúng thường ít độc hại hơn ethidium bromide và có độ nhạy cao hơn, cho phép phát hiện lượng DNA nhỏ hơn.

Giải thích tại sao trong điện di trường xung (PFGE), DNA lớn có thể được phân tách hiệu quả hơn so với điện di agarose thông thường?

Trả lời: Trong PFGE, điện trường được thay đổi định kỳ theo nhiều hướng. Sự thay đổi này buộc các phân tử DNA lớn phải thay đổi hướng di chuyển, và phân tử càng lớn thì việc thay đổi hướng càng khó khăn và mất thời gian hơn. Nhờ vậy, các phân tử DNA lớn được phân tách dựa trên khả năng “reorient” theo hướng điện trường mới, tạo ra sự phân tách hiệu quả hơn so với điện di agarose thông thường, nơi chỉ dựa trên kích thước để phân tách.

Kỹ thuật điện di mao quản có những ưu điểm gì so với điện di trên gel agarose?

Trả lời: Điện di mao quản có nhiều ưu điểm so với điện di gel agarose, bao gồm:

• Tự động hóa: Quá trình điện di và phát hiện được tự động hóa, giảm thiểu thao tác thủ công.
• Nhanh chóng: Thời gian phân tích nhanh hơn đáng kể so với điện di gel.
• Độ phân giải cao: Cho phép phân tách các phân tử có kích thước rất gần nhau.
• Lượng mẫu nhỏ: Chỉ cần một lượng mẫu rất nhỏ để phân tích.

Tuy nhiên, điện di mao quản thường đắt hơn so với điện di gel agarose.