Điện di trên gel polyacrylamide (Polyacrylamide gel electrophoresis/PAGE)

Điện di trên gel polyacrylamide (PAGE) là một kỹ thuật được sử dụng rộng rãi trong sinh học phân tử, hóa sinh và di truyền học để phân tách các đại phân tử sinh học, chủ yếu là protein và axit nucleic, dựa trên kích thước và điện tích của chúng. Kỹ thuật này sử dụng một gel làm từ polyacrylamide như một môi trường hỗ trợ và một điện trường để đẩy các phân tử qua gel. Việc phân tách đạt được do sự di chuyển khác nhau của các phân tử qua mạng lưới gel polyacrylamide.

Nguyên lý hoạt động

PAGE dựa trên nguyên lý rằng các phân tử mang điện sẽ di chuyển trong một điện trường. Tốc độ di chuyển của một phân tử phụ thuộc vào một số yếu tố, bao gồm:

Kích thước: Phân tử nhỏ hơn sẽ di chuyển nhanh hơn qua mạng lưới gel so với phân tử lớn hơn. Mạng lưới gel hoạt động như một “rây phân tử”, cản trở sự di chuyển của các phân tử lớn hơn.
Điện tích: Phân tử mang điện tích cao hơn (tuyệt đối) sẽ di chuyển nhanh hơn trong điện trường. Hướng di chuyển phụ thuộc vào bản chất của điện tích (âm hoặc dương) và hướng của điện trường.
Hình dạng: Phân tử có hình dạng gọn gàng (ví dụ: hình cầu) sẽ di chuyển nhanh hơn so với phân tử có hình dạng phức tạp, do ma sát với mạng lưới gel.
Nồng độ gel: Nồng độ polyacrylamide càng cao, mạng lưới gel càng chặt, làm chậm tốc độ di chuyển của các phân tử. Việc lựa chọn nồng độ gel phù hợp rất quan trọng để đạt được sự phân tách tối ưu cho một khoảng kích thước phân tử cụ thể. Nồng độ gel thường được biểu thị bằng phần trăm (%T) của tổng acrylamide và bis-acrylamide.

Thành phần của gel polyacrylamide

Gel polyacrylamide được hình thành bằng cách trùng hợp acrylamide và một tác nhân liên kết ngang, thường là N,N’-methylenebisacrylamide (BIS). Nồng độ của acrylamide và BIS quyết định kích thước lỗ của gel, do đó ảnh hưởng đến khả năng phân tách các phân tử có kích thước khác nhau. Phản ứng trùng hợp được xúc tác bởi ammonium persulfate (APS) và tetramethylethylenediamine (TEMED). APS tạo ra các gốc tự do sulfat, khởi đầu phản ứng trùng hợp, trong khi TEMED xúc tác sự hình thành các gốc tự do từ APS.

Các loại PAGE

Có nhiều loại PAGE khác nhau, mỗi loại được thiết kế để phân tách các loại phân tử hoặc đạt được các mục tiêu phân tách cụ thể:

Điện di SDS-PAGE (Sodium dodecyl sulfate-PAGE): Đây là loại PAGE biến tính phổ biến nhất để phân tách protein. SDS là một chất tẩy rửa anion làm biến tính protein và phủ lên chúng một điện tích âm tỷ lệ với khối lượng phân tử. Do đó, sự phân tách chủ yếu dựa trên kích thước, cho phép ước tính khối lượng phân tử của protein.
Điện di Native-PAGE: Kỹ thuật này phân tách protein ở trạng thái tự nhiên, không biến tính. Sự phân tách dựa trên cả kích thước và điện tích của protein, cũng như hình dạng của chúng. Native-PAGE hữu ích cho việc nghiên cứu các tương tác protein và phân tích hoạt tính enzyme.
Điện di 2D-PAGE: Kết hợp hai kỹ thuật điện di khác nhau, thường là isoelectric focusing (IEF) và SDS-PAGE, để phân tách protein theo điểm đẳng điện và khối lượng phân tử. Kỹ thuật này cho phép phân tích proteome phức tạp với độ phân giải cao.
Điện di PAGE cho axit nucleic: PAGE cũng được sử dụng để phân tách các đoạn DNA và RNA. Nồng độ gel thấp hơn được sử dụng để phân tách các phân tử lớn hơn. PAGE thường được sử dụng để phân tích các đoạn DNA sau khi PCR, phân tích sản phẩm phản ứng enzyme giới hạn, và phân tích RNA.

Ứng dụng của PAGE

PAGE có nhiều ứng dụng trong nghiên cứu sinh học, bao gồm:

Xác định khối lượng phân tử protein: Bằng cách so sánh tốc độ di chuyển của protein chưa biết với protein chuẩn có khối lượng phân tử đã biết trên gel SDS-PAGE.
Phân tích độ tinh sạch protein: Một protein tinh khiết sẽ xuất hiện dưới dạng một băng duy nhất trên gel.
Nghiên cứu tương tác protein-protein: Ví dụ, thông qua kỹ thuật co-immunoprecipitation kết hợp với Western blot.
Phân tích DNA và RNA: Ví dụ, xác định kích thước của các đoạn DNA sau khi PCR, phân tích sản phẩm phản ứng enzyme giới hạn, và xác định trình tự nucleotide.
Phát hiện đột biến gen: Bằng cách so sánh kiểu di chuyển của các đoạn DNA trên gel, có thể phát hiện các đột biến gây ra sự thay đổi về kích thước hoặc hình dạng của đoạn DNA.

Ưu điểm của PAGE

Độ phân giải cao: PAGE có thể phân tách các phân tử có sự khác biệt về kích thước rất nhỏ, cho phép phân biệt các protein hoặc axit nucleic có kích thước gần giống nhau.
Đơn giản và dễ thực hiện: Kỹ thuật PAGE tương đối đơn giản và không yêu cầu thiết bị quá phức tạp.
Chi phí thấp: So với các kỹ thuật phân tách khác, PAGE có chi phí thấp hơn.

Nhược điểm của PAGE

Polyacrylamide là chất độc hại cần được xử lý cẩn thận: Acrylamide chưa trùng hợp có thể hấp thụ qua da và gây độc thần kinh. Cần phải đeo găng tay và kính bảo hộ khi làm việc với acrylamide.
Có thể khó khăn khi phân tách các protein có khối lượng phân tử rất lớn hoặc rất nhỏ: Việc lựa chọn nồng độ gel phù hợp rất quan trọng để phân tách hiệu quả.

PAGE là một kỹ thuật mạnh mẽ và linh hoạt được sử dụng rộng rãi trong nghiên cứu sinh học để phân tách và phân tích các đại phân tử. Nó cung cấp độ phân giải cao, đơn giản và tiết kiệm chi phí, nhưng cần thận trọng khi xử lý acrylamide.

Quy trình thực hiện SDS-PAGE (ví dụ)

Mặc dù quy trình chi tiết có thể thay đổi tùy thuộc vào ứng dụng cụ thể, quy trình chung cho SDS-PAGE bao gồm các bước sau:

Chuẩn bị mẫu: Protein được xử lý bằng SDS và một tác nhân khử (ví dụ, β-mercaptoethanol) để biến tính và phủ lên chúng một điện tích âm tỷ lệ với khối lượng. Mẫu cũng được đun nóng để hỗ trợ quá trình biến tính.
Chuẩn bị gel: Gel polyacrylamide được đổ giữa hai tấm kính tạo thành một bản gel mỏng. Gel thường bao gồm hai phần: gel “stacking” (nồng độ thấp) và gel “resolving” (nồng độ cao). Gel stacking giúp tập trung các protein thành một dải hẹp trước khi chúng đi vào gel resolving, nơi diễn ra sự phân tách theo kích thước.
Điện di: Bản gel được đặt trong một bể điện di chứa dung dịch đệm. Mẫu được nạp vào các giếng trên gel. Một điện trường được áp dụng, và các protein di chuyển từ cực âm sang cực dương.
Nhuộm gel: Sau khi điện di, gel được nhuộm bằng thuốc nhuộm (ví dụ, Coomassie Brilliant Blue) để hiển thị các băng protein. Các thuốc nhuộm khác như bạc cũng có thể được sử dụng để tăng độ nhạy.
Phân tích: Kích thước của các protein được ước tính bằng cách so sánh vị trí của chúng trên gel với protein marker có khối lượng phân tử đã biết.

Các yếu tố ảnh hưởng đến PAGE

Nồng độ acrylamide: Ảnh hưởng đến kích thước lỗ của gel và do đó ảnh hưởng đến phạm vi phân tách khối lượng phân tử.
Độ pH của dung dịch đệm: Ảnh hưởng đến điện tích của protein và do đó ảnh hưởng đến tốc độ di chuyển.
Cường độ điện trường: Điện trường mạnh hơn sẽ làm tăng tốc độ di chuyển nhưng cũng có thể tạo ra nhiệt, ảnh hưởng đến chất lượng gel.
Thời gian điện di: Thời gian điện di quá ngắn sẽ không cho phép protein phân tách hoàn toàn, trong khi thời gian quá dài có thể làm cho protein chạy ra khỏi gel.

Biến thể của PAGE

Ngoài SDS-PAGE và Native-PAGE, còn có một số biến thể khác của PAGE, bao gồm:

Gradient PAGE: Sử dụng gel có nồng độ acrylamide thay đổi theo chiều dọc, cho phép phân tách protein trong một phạm vi khối lượng phân tử rộng hơn.
Isoelectric focusing (IEF): Phân tách protein dựa trên điểm đẳng điện của chúng.
2D-PAGE: Kết hợp IEF và SDS-PAGE để phân tách protein theo cả điểm đẳng điện và khối lượng phân tử.

An toàn khi làm việc với PAGE

Acrylamide là một chất độc thần kinh và cần được xử lý cẩn thận. Nên đeo găng tay và kính bảo hộ khi làm việc với acrylamide. APS và TEMED cũng có thể gây kích ứng da và mắt. Cần xử lý chất thải theo quy định an toàn.

Tóm tắt về Điện di trên gel polyacrylamide

Điện di trên gel polyacrylamide (PAGE) là một kỹ thuật thiết yếu trong sinh học phân tử để phân tách các đại phân tử như protein và axit nucleic. Nguyên lý cốt lõi của kỹ thuật này dựa trên sự di chuyển của các phân tử mang điện trong một điện trường, với tốc độ di chuyển bị ảnh hưởng bởi kích thước, điện tích, hình dạng phân tử và nồng độ gel.

SDS-PAGE là một biến thể phổ biến, sử dụng sodium dodecyl sulfate (SDS) để biến tính protein và phủ lên chúng một điện tích âm đồng nhất, cho phép phân tách dựa trên kích thước. Ngược lại, Native-PAGE phân tách protein ở trạng thái tự nhiên, dựa trên cả kích thước và điện tích. Các biến thể khác như 2D-PAGE và gradient PAGE cung cấp khả năng phân tách phức tạp hơn.

Việc lựa chọn nồng độ acrylamide, thành phần dung dịch đệm, cường độ điện trường và thời gian điện di là rất quan trọng để tối ưu hóa quá trình phân tách. Cần cẩn thận khi xử lý acrylamide, một chất độc hại, và các hóa chất khác được sử dụng trong PAGE. Đeo găng tay và kính bảo hộ là điều cần thiết để đảm bảo an toàn trong phòng thí nghiệm.

Hiểu rõ nguyên lý, quy trình và các yếu tố ảnh hưởng đến PAGE là rất quan trọng để đạt được kết quả chính xác và đáng tin cậy trong nghiên cứu sinh học. Ứng dụng của PAGE rất đa dạng, từ xác định khối lượng phân tử protein đến phân tích tương tác protein và nghiên cứu axit nucleic.

Tài liệu tham khảo:

Wilson, K., Walker, J. (2018). Principles and Techniques of Biochemistry and Molecular Biology (8th ed.). Cambridge University Press.
Sambrook, J., Fritsch, E. F., & Maniatis, T. (1989). Molecular cloning: a laboratory manual (2nd ed.). Cold Spring Harbor Laboratory Press.
Laemmli, U. K. (1970). Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature, 227(5259), 680–685.

Câu hỏi và Giải đáp

Tại sao SDS lại quan trọng trong SDS-PAGE và nó ảnh hưởng đến sự phân tách protein như thế nào?

Trả lời: SDS, một chất tẩy rửa anion, đóng vai trò quan trọng trong SDS-PAGE bằng cách biến tính protein và phủ lên chúng một điện tích âm tỷ lệ với khối lượng phân tử. Việc biến tính protein làm mất cấu trúc ba chiều của chúng, đảm bảo rằng sự phân tách chủ yếu dựa trên kích thước chứ không phải hình dạng hay điện tích ban đầu. Điện tích âm đồng nhất từ SDS lấn át điện tích tự nhiên của protein, khiến tất cả protein di chuyển về phía cực dương.

Sự khác biệt chính giữa Native-PAGE và SDS-PAGE là gì, và khi nào nên sử dụng mỗi kỹ thuật?

Trả lời: Sự khác biệt chính nằm ở việc sử dụng SDS. SDS-PAGE biến tính protein và phân tách dựa trên kích thước, trong khi Native-PAGE phân tách protein ở trạng thái tự nhiên, dựa trên cả kích thước và điện tích. Sử dụng SDS-PAGE khi cần xác định khối lượng phân tử protein hoặc phân tích độ tinh khiết. Sử dụng Native-PAGE khi cần nghiên cứu hoạt tính enzyme, tương tác protein, hoặc phân tích protein ở dạng phức hợp.

Làm thế nào để chọn nồng độ polyacrylamide phù hợp cho gel PAGE?

Trả lời: Nồng độ polyacrylamide ảnh hưởng đến kích thước lỗ của gel. Nồng độ cao hơn tạo ra lỗ nhỏ hơn, phù hợp để phân tách protein nhỏ. Nồng độ thấp hơn tạo ra lỗ lớn hơn, phù hợp để phân tách protein lớn. Việc chọn nồng độ phụ thuộc vào phạm vi khối lượng phân tử của protein cần phân tách. Ví dụ, gel 10% thường được sử dụng cho protein có khối lượng phân tử từ 30-100 kDa.

Isoelectric focusing (IEF) là gì và nó được sử dụng như thế nào trong 2D-PAGE?

Trả lời: IEF là một kỹ thuật điện di phân tách protein dựa trên điểm đẳng điện (pI) của chúng, tức là pH mà tại đó protein không mang điện tích. Trong 2D-PAGE, IEF được sử dụng làm bước phân tách đầu tiên. Protein được phân tách theo pI trên một gel gradient pH. Sau đó, gel IEF được đặt lên trên một gel SDS-PAGE để phân tách tiếp theo dựa trên kích thước.

Ngoài việc xác định khối lượng phân tử, PAGE còn có những ứng dụng nào khác trong nghiên cứu sinh học?

Trả lời: PAGE có nhiều ứng dụng khác, bao gồm:

Phân tích độ tinh khiết protein: Một băng duy nhất trên gel cho thấy protein tinh khiết.
Nghiên cứu tương tác protein-protein: Ví dụ, co-immunoprecipitation kết hợp với Western blot.
Phân tích DNA và RNA: Xác định kích thước đoạn DNA/RNA, phân tích sản phẩm PCR.
Phát hiện đột biến gen: So sánh kiểu di chuyển của các đoạn DNA.
Kiểm tra chất lượng protein: Đánh giá sự phân hủy hoặc biến đổi protein.

Một số điều thú vị về Điện di trên gel polyacrylamide

“Ma trận phân tử”: Gel polyacrylamide hoạt động như một “ma trận phân tử”, với kích thước lỗ được điều chỉnh cẩn thận. Hãy tưởng tượng nó như một cái sàng phân tử, nơi các phân tử nhỏ luồn lách qua dễ dàng, trong khi các phân tử lớn bị kẹt lại. Sự điều chỉnh nồng độ acrylamide và BIS cho phép các nhà khoa học “thiết kế” kích thước lỗ phù hợp với nhu cầu phân tách của họ.
“Cuộc đua phân tử”: Điện trường trong PAGE tạo ra một “cuộc đua phân tử”, nơi các phân tử mang điện chạy đua về phía cực đối diện. Điều thú vị là, không phải lúc nào “nhanh nhất” cũng “thắng”. Trong Native-PAGE, điện tích của protein cũng đóng vai trò quan trọng, một protein nhỏ nhưng mang điện tích thấp có thể bị một protein lớn hơn nhưng mang điện tích cao vượt mặt.
Màu sắc tiết lộ bí mật: Thuốc nhuộm như Coomassie Brilliant Blue liên kết với protein và làm chúng hiện hình thành các băng màu xanh trên gel. Sự đậm nhạt của băng tương quan với lượng protein, giúp các nhà khoa học định lượng được protein mục tiêu.
Từ gel đến bản đồ protein: 2D-PAGE tạo ra những “bản đồ protein” phức tạp, hiển thị hàng trăm, thậm chí hàng ngàn protein trong một mẫu duy nhất. Kỹ thuật này giống như việc tạo ra một “dấu vân tay phân tử” cho một tế bào hay một mô, giúp các nhà khoa học nghiên cứu sự biểu hiện protein trong các điều kiện khác nhau.
Tìm kiếm protein “ẩn danh”: Kết hợp PAGE với Western blot cho phép các nhà khoa học xác định một protein cụ thể trong một hỗn hợp phức tạp. Kỹ thuật này giống như việc “truy nã” một protein “ẩn danh” bằng cách sử dụng một “kháng thể đặc hiệu” như một “lệnh truy nã”.
“Người khổng lồ” và “chú lùn” phân tử: PAGE gặp khó khăn khi phân tách các protein quá lớn hoặc quá nhỏ. Các protein quá lớn có thể bị mắc kẹt ở đầu gel, trong khi các protein quá nhỏ có thể chạy thẳng ra khỏi gel mà không bị phân tách. Các kỹ thuật đặc biệt, như sử dụng gel gradient hoặc thay đổi thành phần dung dịch đệm, có thể giúp khắc phục những hạn chế này.