Đo tế bào dòng chảy đa thông số (Multiparameter Flow Cytometry)

Nguyên lý hoạt động

Quá trình đo tế bào dòng chảy đa thông số bao gồm các bước sau:

• Chuẩn bị mẫu: Tế bào được nhuộm huỳnh quang với các kháng thể đặc hiệu liên kết với các protein hoặc các phân tử quan tâm khác trên bề mặt hoặc bên trong tế bào. Mỗi kháng thể được liên kết với một fluorophore (chất phát huỳnh quang) khác nhau, phát ra ánh sáng ở một bước sóng cụ thể khi được kích thích bởi laser. Việc lựa chọn fluorophore phù hợp rất quan trọng để tránh chồng chéo quang phổ và đảm bảo tín hiệu rõ ràng cho từng thông số.
• Dòng chảy tế bào: Mẫu tế bào được đưa vào máy đo tế bào dòng chảy, nơi chúng được tập trung thành một dòng tế bào đơn lẻ đi qua một hoặc nhiều chùm tia laser. Hệ thống thủy động học đảm bảo rằng các tế bào đi qua laser từng tế bào một, cho phép phân tích riêng lẻ từng tế bào.
• Tán xạ ánh sáng: Khi mỗi tế bào đi qua chùm tia laser, nó tán xạ ánh sáng theo nhiều hướng. Tán xạ ánh sáng phía trước (Forward Scatter – FSC) cung cấp thông tin về kích thước tương đối của tế bào, trong khi tán xạ ánh sáng bên (Side Scatter – SSC) cung cấp thông tin về độ hạt hoặc phức tạp bên trong của tế bào (ví dụ: hàm lượng hạt, hình dạng, cấu trúc bên trong).
• Huỳnh quang: Các fluorophore được gắn vào kháng thể được kích thích bởi laser và phát ra ánh sáng ở các bước sóng cụ thể. Ánh sáng phát ra này được phát hiện bởi các bộ dò quang học và cường độ huỳnh quang được đo cho mỗi tế bào. Cường độ huỳnh quang tỷ lệ thuận với lượng phân tử đích (ví dụ: protein) trên hoặc trong tế bào.
• Phân tích dữ liệu: Dữ liệu được thu thập được hiển thị dưới dạng histogram, dot plot, hoặc các đồ thị khác, cho phép người dùng phân tích và định lượng các quần thể tế bào khác nhau dựa trên kích thước, độ hạt và biểu hiện dấu ấn. Các phần mềm phân tích chuyên dụng cho phép phân tích dữ liệu đa chiều và xác định các quần thể tế bào quan tâm.

Ứng dụng

Đo tế bào dòng chảy đa thông số có nhiều ứng dụng rộng rãi trong các lĩnh vực khác nhau, bao gồm:

• Miễn dịch học: Phân tích các quần thể tế bào miễn dịch, chẳng hạn như tế bào lympho T, tế bào lympho B, và tế bào NK. Theo dõi đáp ứng miễn dịch với bệnh tật hoặc điều trị. Đánh giá hiệu quả của vaccine và liệu pháp miễn dịch.
• Ung thư học: Phát hiện và phân loại các tế bào ung thư. Theo dõi hiệu quả điều trị ung thư và phát hiện tế bào ung thư di căn. Xác định các dấu ấn sinh học ung thư và tiên lượng bệnh.
• Huyết học: Đếm và phân loại các tế bào máu. Chẩn đoán các rối loạn về máu như bệnh bạch cầu và các bệnh thiếu máu. Kiểm tra chất lượng máu và theo dõi sức khỏe bệnh nhân.
• Sinh học tế bào và phân tử: Nghiên cứu biểu hiện protein, chu kỳ tế bào và quá trình chết rụng tế bào. Phân tích sự tương tác giữa các tế bào và các phân tử. Nghiên cứu cơ chế bệnh lý ở cấp độ tế bào.
• Vi sinh vật học: Phân tích và phân loại vi khuẩn và các vi sinh vật khác. Đánh giá hoạt động kháng khuẩn của các hợp chất. Nghiên cứu sự tương tác giữa vi sinh vật và vật chủ.

Ưu điểm

• Phân tích đa thông số: Đồng thời đo nhiều thông số trên từng tế bào, cung cấp thông tin phong phú về từng tế bào riêng lẻ.
• Phân tích đơn bào: Cung cấp thông tin chi tiết về sự không đồng nhất của quần thể tế bào, cho phép phân biệt các quần thể tế bào phụ khác nhau.
• Phân tích nhanh chóng và định lượng: Xử lý hàng ngàn tế bào mỗi giây, cung cấp dữ liệu thống kê đáng tin cậy.
• Đa năng: Có thể được sử dụng với nhiều loại tế bào và vi sinh vật, phù hợp cho nhiều ứng dụng nghiên cứu khác nhau.

Nhược điểm

• Chi phí: Máy đo tế bào dòng chảy có thể đắt tiền, đòi hỏi đầu tư đáng kể.
• Độ phức tạp: Yêu cầu kiến thức chuyên môn để vận hành và phân tích dữ liệu. Việc thiết kế thí nghiệm và phân tích kết quả đòi hỏi kinh nghiệm và kỹ năng chuyên môn.
• Chuẩn bị mẫu: Yêu cầu chuẩn bị mẫu cẩn thận để đảm bảo kết quả chính xác. Quá trình nhuộm và xử lý mẫu có thể ảnh hưởng đến kết quả nếu không được thực hiện đúng cách.

Phân tích dữ liệu

Dữ liệu từ đo tế bào dòng chảy đa thông số thường được hiển thị dưới dạng histogram, dot plot, và density plot.

• Histogram: Hiển thị phân bố của một thông số duy nhất, chẳng hạn như cường độ huỳnh quang của một fluorophore cụ thể. Trục x biểu thị cường độ huỳnh quang và trục y biểu thị số lượng tế bào. Histogram giúp đánh giá sự phân bố của một thông số trong quần thể tế bào.
• Dot plot: Hiển thị mối quan hệ giữa hai thông số, ví dụ FSC và SSC, hoặc cường độ huỳnh quang của hai fluorophore khác nhau. Mỗi chấm đại diện cho một tế bào. Dot plot cho phép trực quan hóa mối tương quan giữa hai thông số và xác định các quần thể tế bào khác nhau dựa trên sự kết hợp của các thông số này.
• Density plot: Tương tự như dot plot nhưng sử dụng màu sắc hoặc đường đồng mức để biểu thị mật độ tế bào trong các vùng khác nhau của đồ thị. Vùng có mật độ tế bào cao hơn được biểu thị bằng màu sắc đậm hơn hoặc đường đồng mức dày hơn. Density plot giúp dễ dàng nhận biết các quần thể tế bào chiếm ưu thế và phân bố của chúng trong không gian hai chiều.

Việc phân tích dữ liệu thường bao gồm việc xác định và định lượng các quần thể tế bào khác nhau dựa trên các thông số được đo. Điều này có thể được thực hiện bằng cách sử dụng các cổng (gate), là các vùng được xác định trên dot plot hoặc density plot để chọn các quần thể tế bào cụ thể. Ví dụ, một cổng có thể được sử dụng để chọn tất cả các tế bào dương tính với một dấu ấn bề mặt cụ thể. Việc gating cho phép phân tích chi tiết các quần thể tế bào con và so sánh giữa các mẫu khác nhau.

Các fluorophore thường được sử dụng

Một số fluorophore thường được sử dụng trong đo tế bào dòng chảy đa thông số bao gồm:

• FITC (Fluorescein isothiocyanate): Phát xạ màu xanh lá cây.
• PE (Phycoerythrin): Phát xạ màu cam/đỏ.
• APC (Allophycocyanin): Phát xạ màu đỏ đậm.
• PerCP (Peridinin chlorophyll protein): Phát xạ màu đỏ đậm.
• Các fluorophore tandem: Kết hợp hai hoặc nhiều fluorophore để tạo ra các bước sóng phát xạ khác nhau, cho phép phát hiện nhiều dấu ấn hơn. Ví dụ, PE-Cy7 là một fluorophore tandem kết hợp PE và Cy7, phát xạ ở bước sóng xa đỏ.

Bù trừ huỳnh quang (Compensation)

Do sự chồng chéo phổ phát xạ của các fluorophore khác nhau, cần phải bù trừ huỳnh quang để loại bỏ tín hiệu chồng chéo và đảm bảo đo chính xác cường độ huỳnh quang của từng fluorophore. Bù trừ huỳnh quang liên quan đến việc trừ đi một phần tín hiệu của một fluorophore khỏi tín hiệu của fluorophore khác để hiệu chỉnh sự chồng chéo này. Việc bù trừ huỳnh quang là bước quan trọng để đảm bảo độ chính xác của kết quả đo.

Những tiến bộ gần đây

• Đo tế bào dòng chảy khối phổ (Mass cytometry/CyTOF): Sử dụng các kháng thể được gắn với các đồng vị kim loại thay vì fluorophore, cho phép phân tích đồng thời nhiều dấu ấn hơn (lên đến 40-50) với ít chồng chéo tín hiệu hơn. Kỹ thuật này mở ra khả năng nghiên cứu sự phức tạp của hệ thống miễn dịch ở mức độ chi tiết hơn.
• Đo tế bào dòng chảy hình ảnh (Imaging flow cytometry): Kết hợp đo tế bào dòng chảy truyền thống với kính hiển vi huỳnh quang, cho phép hình dung các tế bào riêng lẻ và phân tích vị trí dưới tế bào của các protein và các phân tử khác. Kỹ thuật này cung cấp thông tin về hình thái tế bào và sự phân bố không gian của các phân tử bên trong tế bào.