ELISA (ELISA)

ELISA (Xét nghiệm miễn dịch hấp phụ liên kết enzyme) là một kỹ thuật sinh hóa được sử dụng rộng rãi để phát hiện và định lượng các kháng nguyên hoặc kháng thể trong một mẫu. Phương pháp này dựa trên nguyên tắc liên kết đặc hiệu giữa kháng nguyên và kháng thể, kết hợp với phản ứng enzym tạo màu để định lượng. ELISA có nhiều ứng dụng trong y học, nghiên cứu sinh học và kiểm soát chất lượng thực phẩm.

Nguyên lý hoạt động

ELISA dựa trên việc cố định kháng nguyên hoặc kháng thể lên bề mặt rắn (thường là đĩa microtiter 96 giếng). Sau đó, mẫu cần xét nghiệm được thêm vào, và nếu có kháng nguyên hoặc kháng thể tương ứng, chúng sẽ liên kết với phần tử đã được cố định. Quá trình này tận dụng tính đặc hiệu cao của liên kết kháng nguyên – kháng thể. Tiếp theo, một kháng thể thứ hai được gắn enzyme (kháng thể liên hợp enzyme) được thêm vào. Kháng thể này sẽ liên kết với kháng nguyên hoặc kháng thể đã liên kết trước đó. Việc sử dụng kháng thể thứ hai giúp khuếch đại tín hiệu và tăng độ nhạy của xét nghiệm. Cuối cùng, một cơ chất đặc hiệu cho enzyme được thêm vào. Enzyme sẽ xúc tác phản ứng chuyển đổi cơ chất thành sản phẩm có màu. Cường độ màu tỉ lệ thuận với lượng kháng nguyên hoặc kháng thể trong mẫu. Việc đo cường độ màu này bằng thiết bị đo quang phổ cho phép định lượng được nồng độ của kháng nguyên hoặc kháng thể cần xét nghiệm.

Các loại ELISA

Có nhiều loại ELISA khác nhau, nhưng bốn loại phổ biến nhất bao gồm:

ELISA trực tiếp: Kháng nguyên được cố định trên đĩa. Kháng thể gắn enzyme được thêm vào trực tiếp để liên kết với kháng nguyên. Phương pháp này nhanh chóng nhưng ít nhạy hơn các loại ELISA khác.
ELISA gián tiếp: Kháng nguyên được cố định trên đĩa. Kháng thể không gắn enzyme (kháng thể sơ cấp) được thêm vào để liên kết với kháng nguyên. Sau đó, kháng thể gắn enzyme (kháng thể thứ cấp) được thêm vào để liên kết với kháng thể sơ cấp. Phương pháp này nhạy hơn ELISA trực tiếp do có sự khuếch đại tín hiệu.
ELISA sandwich: Kháng thể bắt giữ được cố định trên đĩa. Kháng nguyên trong mẫu được thêm vào và liên kết với kháng thể bắt giữ. Sau đó, một kháng thể phát hiện gắn enzyme được thêm vào để liên kết với kháng nguyên. Kiểu sandwich có thể sử dụng cùng một kháng thể phát hiện hoặc kháng thể thứ hai đặc hiệu với một epitope khác của kháng nguyên. Phương pháp này có độ đặc hiệu và độ nhạy cao.
ELISA cạnh tranh: Kháng nguyên trong mẫu cạnh tranh với kháng nguyên đã được đánh dấu để liên kết với kháng thể cố định trên đĩa. Nồng độ kháng nguyên trong mẫu càng cao, tín hiệu càng yếu. Phương pháp này thường được sử dụng để định lượng các phân tử nhỏ.

Ưu điểm của ELISA

Độ nhạy cao: ELISA có thể phát hiện các kháng nguyên hoặc kháng thể ở nồng độ rất thấp.
Tính đặc hiệu cao: Kháng thể được sử dụng trong ELISA rất đặc hiệu, cho phép phát hiện chính xác các kháng nguyên hoặc kháng thể mong muốn.
Đơn giản và dễ thực hiện: Quy trình ELISA tương đối đơn giản và có thể được tự động hóa.
Chi phí thấp: ELISA là một kỹ thuật tương đối rẻ so với các kỹ thuật khác.

Nhược điểm của ELISA

Kết quả dương tính giả: Có thể xảy ra do phản ứng chéo của kháng thể với các phân tử khác trong mẫu. Cần lựa chọn kháng thể có độ đặc hiệu cao để giảm thiểu hiện tượng này.
Kết quả âm tính giả: Có thể xảy ra do nồng độ kháng nguyên hoặc kháng thể trong mẫu quá thấp hoặc do mẫu bị biến tính. Cần tối ưu hóa các bước trong quy trình ELISA và đảm bảo chất lượng mẫu để tránh kết quả âm tính giả.
Thời gian thực hiện: Mặc dù đơn giản, ELISA vẫn cần thời gian cho các bước ủ và rửa. Tùy thuộc vào loại ELISA, thời gian thực hiện có thể từ vài giờ đến một ngày.

Ứng dụng

ELISA được sử dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực, bao gồm:

Chẩn đoán bệnh: Phát hiện các kháng thể chống lại các tác nhân gây bệnh như HIV, viêm gan B, viêm gan C, Rubella, Toxoplasma, v.v. ELISA cũng được sử dụng để phát hiện kháng nguyên của một số tác nhân gây bệnh.
Nghiên cứu y sinh: Nghiên cứu về đáp ứng miễn dịch, cơ chế bệnh sinh, và phát triển thuốc. ELISA là một công cụ quan trọng để nghiên cứu về cytokine, hormone, và các protein khác.
Kiểm nghiệm thực phẩm: Phát hiện các chất gây dị ứng, độc tố, và các chất gây ô nhiễm trong thực phẩm. Ví dụ, ELISA có thể được sử dụng để phát hiện sự tồn tại của gluten trong thực phẩm dành cho người bị bệnh celiac.
Kiểm nghiệm môi trường: Phát hiện các chất ô nhiễm trong nước và đất. ELISA có thể được sử dụng để định lượng các chất ô nhiễm như thuốc trừ sâu và kim loại nặng.

ELISA là một kỹ thuật mạnh mẽ và linh hoạt với nhiều ứng dụng trong nhiều lĩnh vực. Tính đơn giản, độ nhạy cao, và chi phí thấp đã khiến ELISA trở thành một công cụ quan trọng trong chẩn đoán, nghiên cứu và kiểm soát chất lượng.

Các bước thực hiện ELISA

Mặc dù có nhiều biến thể ELISA, nhưng các bước cơ bản thường bao gồm:

Bao phủ (Coating): Kháng nguyên hoặc kháng thể được cố định lên bề mặt của giếng trong đĩa microtiter. Quá trình này thường được thực hiện bằng cách ủ dung dịch kháng nguyên hoặc kháng thể trong giếng qua đêm ở 4°C. Lựa chọn kháng nguyên hoặc kháng thể cố định phụ thuộc vào loại ELISA được sử dụng.
Chặn (Blocking): Sau khi bao phủ, các vị trí liên kết không đặc hiệu trên bề mặt giếng được chặn bằng protein không liên quan, chẳng hạn như albumin huyết thanh bò (BSA) hoặc casein. Bước này ngăn chặn sự liên kết không đặc hiệu của các kháng thể hoặc kháng nguyên khác trong các bước tiếp theo. Điều này giúp giảm thiểu tín hiệu nền và tăng độ chính xác của xét nghiệm.
Ủ mẫu (Incubation with sample): Mẫu cần xét nghiệm được thêm vào giếng và ủ trong một khoảng thời gian nhất định để cho phép kháng nguyên hoặc kháng thể trong mẫu liên kết với kháng nguyên hoặc kháng thể đã được bao phủ. Thời gian ủ và nhiệt độ phụ thuộc vào loại ELISA và kháng thể được sử dụng.
Rửa (Washing): Giếng được rửa kỹ nhiều lần để loại bỏ bất kỳ kháng nguyên hoặc kháng thể nào không liên kết. Bước này rất quan trọng để loại bỏ các tín hiệu nền và đảm bảo độ chính xác của xét nghiệm.
Ủ kháng thể gắn enzyme (Incubation with enzyme-conjugated antibody): Kháng thể gắn enzyme được thêm vào giếng và ủ. Kháng thể này sẽ liên kết với kháng nguyên hoặc kháng thể đã liên kết trong bước ủ mẫu.
Rửa (Washing): Giếng được rửa lại để loại bỏ bất kỳ kháng thể gắn enzyme nào không liên kết.
Thêm cơ chất (Adding substrate): Cơ chất đặc hiệu cho enzyme được thêm vào giếng. Enzyme sẽ xúc tác phản ứng chuyển đổi cơ chất thành sản phẩm có màu. Cường độ màu tỉ lệ thuận với lượng kháng nguyên hoặc kháng thể trong mẫu.
Đo mật độ quang (Measuring absorbance): Cường độ màu được đo bằng máy đo quang phổ ở bước sóng thích hợp. Bước sóng được sử dụng phụ thuộc vào loại cơ chất được sử dụng.

Phân tích kết quả

Kết quả ELISA thường được biểu diễn dưới dạng mật độ quang (OD). Để định lượng kháng nguyên hoặc kháng thể trong mẫu, cần xây dựng đường chuẩn bằng cách sử dụng các nồng độ kháng nguyên hoặc kháng thể đã biết. Đường chuẩn là đồ thị biểu diễn mối quan hệ giữa mật độ quang và nồng độ. Từ đường chuẩn, có thể xác định nồng độ kháng nguyên hoặc kháng thể trong mẫu chưa biết.

Các yếu tố ảnh hưởng đến kết quả ELISA

Nhiệt độ và thời gian ủ: Nhiệt độ và thời gian ủ ảnh hưởng đến tốc độ và hiệu quả của phản ứng kháng nguyên-kháng thể.
Nồng độ kháng thể và kháng nguyên: Nồng độ kháng thể và kháng nguyên phải được tối ưu hóa để đạt được độ nhạy và đặc hiệu cao nhất.
Chất lượng thuốc thử: Chất lượng của kháng thể, enzyme và cơ chất ảnh hưởng đến độ tin cậy của kết quả.
Quy trình rửa: Quy trình rửa phải được thực hiện cẩn thận để loại bỏ hoàn toàn các kháng thể hoặc kháng nguyên không liên kết.

Tóm tắt về ELISA

ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) là một kỹ thuật xét nghiệm sinh hóa quan trọng được sử dụng rộng rãi để phát hiện và định lượng kháng nguyên hoặc kháng thể. Tính đặc hiệu của phản ứng kháng nguyên-kháng thể là nền tảng cho độ chính xác của ELISA. Việc lựa chọn kháng thể phù hợp, cả kháng thể bắt giữ và kháng thể phát hiện, đóng vai trò then chốt trong việc đảm bảo tính đặc hiệu và độ nhạy của xét nghiệm.

Quy trình ELISA bao gồm nhiều bước quan trọng, từ bao phủ, chặn, ủ mẫu, rửa, đến thêm cơ chất và đo mật độ quang. Mỗi bước đều cần được thực hiện cẩn thận và chính xác để tránh sai số và đảm bảo kết quả đáng tin cậy. Đặc biệt, bước rửa rất quan trọng để loại bỏ các thành phần không liên kết và giảm nhiễu nền.

Việc kiểm soát các yếu tố ảnh hưởng đến ELISA cũng rất cần thiết. Nhiệt độ, thời gian ủ, và nồng độ các thuốc thử cần được tối ưu hóa cho từng xét nghiệm cụ thể. Sử dụng đường chuẩn cho phép định lượng chính xác nồng độ kháng nguyên hoặc kháng thể trong mẫu chưa biết. Việc phân tích và diễn giải kết quả ELISA cần được thực hiện cẩn thận, cân nhắc các yếu tố có thể ảnh hưởng đến kết quả và đối chiếu với các phương pháp xét nghiệm khác nếu cần. Hiểu rõ nguyên lý và các bước thực hiện của ELISA sẽ giúp người sử dụng thực hiện xét nghiệm một cách chính xác và hiệu quả.

Tài liệu tham khảo:

Crowther, J. R. (2001). The ELISA guidebook. Humana Press.
Lequin, R. M. (2005). Enzyme immunoassay (EIA)/enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Clinical chemistry, 51(12), 2415-2418.
Engvall, E., & Perlmann, P. (1971). Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Quantitative assay of immunoglobulin G. Immunochemistry, 8(9), 871-874.

Câu hỏi và Giải đáp

Sự khác biệt chính giữa ELISA trực tiếp và ELISA gián tiếp là gì? Ưu điểm và nhược điểm của từng phương pháp là gì?

Trả lời: ELISA trực tiếp sử dụng kháng thể gắn enzyme liên kết trực tiếp với kháng nguyên đích. ELISA gián tiếp sử dụng kháng thể sơ cấp không gắn enzyme để liên kết với kháng nguyên, sau đó sử dụng kháng thể thứ cấp gắn enzyme để phát hiện kháng thể sơ cấp.

Ưu điểm ELISA trực tiếp: Nhanh hơn, ít bước hơn, giảm thiểu phản ứng chéo.
Nhược điểm ELISA trực tiếp: Ít nhạy hơn ELISA gián tiếp, ít tín hiệu khuếch đại, tính linh hoạt bị hạn chế.
Ưu điểm ELISA gián tiếp: Nhạy hơn do tín hiệu khuếch đại, linh hoạt hơn trong việc lựa chọn kháng thể thứ cấp.
Nhược điểm ELISA gián tiếp: Nhiều bước hơn, mất nhiều thời gian hơn, tăng khả năng phản ứng chéo.

Làm thế nào để xác định nồng độ kháng nguyên chưa biết trong một mẫu bằng ELISA?

Trả lời: Nồng độ kháng nguyên chưa biết được xác định bằng cách sử dụng đường chuẩn. Đường chuẩn được xây dựng bằng cách chạy ELISA với các nồng độ kháng nguyên đã biết và đo mật độ quang tương ứng. Sau đó, vẽ đồ thị biểu diễn mối quan hệ giữa mật độ quang và nồng độ. Từ đường chuẩn này, có thể xác định nồng độ kháng nguyên trong mẫu chưa biết dựa trên mật độ quang đo được.

Tại sao bước chặn (blocking) lại quan trọng trong quy trình ELISA? Loại dung dịch nào thường được sử dụng cho bước này?

Trả lời: Bước chặn ngăn chặn sự liên kết không đặc hiệu của các kháng thể với đĩa. Điều này giúp giảm nhiễu nền và tăng độ chính xác của kết quả. Các dung dịch chặn phổ biến bao gồm albumin huyết thanh bò (BSA), casein, và sữa bột không béo.

Kể tên một số ứng dụng của ELISA ngoài chẩn đoán y tế.

Trả lời: ELISA được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực khác nhau, bao gồm:

Kiểm nghiệm an toàn thực phẩm: Phát hiện các chất gây dị ứng, độc tố, và vi sinh vật gây bệnh.
Giám sát môi trường: Phát hiện các chất ô nhiễm trong nước, đất và không khí.
Nghiên cứu nông nghiệp: Phát hiện virus thực vật và kiểm tra chất lượng sản phẩm nông nghiệp.
Kiểm tra thú y: Chẩn đoán bệnh ở động vật.

Các yếu tố nào có thể gây ra kết quả dương tính giả hoặc âm tính giả trong ELISA?

Trả lời:

Dương tính giả: Phản ứng chéo của kháng thể, ô nhiễm mẫu, rửa không đúng cách.
Âm tính giả: Nồng độ kháng nguyên quá thấp, mẫu bị biến tính, kháng thể không hoạt động, ủ không đúng cách.

Một số điều thú vị về ELISA

ELISA không phải lúc nào cũng tạo ra màu: Mặc dù hầu hết các xét nghiệm ELISA sử dụng phản ứng tạo màu để phát hiện, một số biến thể sử dụng các chất phát huỳnh quang hoặc phát quang hóa học, cho phép phát hiện tín hiệu nhạy hơn. Điều này đặc biệt hữu ích khi xét nghiệm các mẫu có nồng độ analyte rất thấp.
ELISA có thể được sử dụng để phát hiện các phân tử nhỏ: Ban đầu ELISA chủ yếu được sử dụng để phát hiện protein, nhưng hiện nay kỹ thuật này đã được mở rộng để phát hiện các phân tử nhỏ như hapten (các phân tử nhỏ có khả năng kích thích đáp ứng miễn dịch khi kết hợp với một protein mang). Điều này mở ra khả năng ứng dụng ELISA trong nhiều lĩnh vực khác nhau, từ kiểm tra an toàn thực phẩm đến giám sát môi trường.
ELISA đóng vai trò quan trọng trong việc chẩn đoán HIV: ELISA là một trong những xét nghiệm đầu tiên được sử dụng để phát hiện kháng thể chống HIV trong máu. Sự phát triển của xét nghiệm ELISA cho HIV đã đánh dấu một bước ngoặt quan trọng trong việc chẩn đoán và quản lý bệnh này.
ELISA có thể được thực hiện trên nhiều loại mẫu khác nhau: Không chỉ giới hạn ở huyết thanh và huyết tương, ELISA có thể được sử dụng để phân tích nhiều loại mẫu sinh học khác nhau, bao gồm nước tiểu, nước bọt, dịch não tủy, và thậm chí cả mô tế bào. Điều này làm tăng tính linh hoạt của kỹ thuật này trong các ứng dụng nghiên cứu và chẩn đoán.
Tên gọi ELISA ban đầu gây tranh cãi: Khi mới được phát triển, có một số tranh luận về tên gọi của kỹ thuật này. Một số nhà khoa học ủng hộ tên gọi “enzyme immunoassay” (EIA), trong khi những người khác đề xuất “enzyme-linked immunosorbent assay” (ELISA). Cuối cùng, tên gọi ELISA đã được chấp nhận rộng rãi hơn.
ELISA đang được phát triển liên tục: Các nhà nghiên cứu đang liên tục tìm cách cải tiến ELISA để tăng độ nhạy, độ đặc hiệu, và giảm thời gian thực hiện. Các phương pháp mới như ELISA điện hóa và ELISA kỹ thuật số đang được phát triển và hứa hẹn mang lại những tiến bộ đáng kể trong lĩnh vực này.