Kính hiển vi điện tử quét truyền qua lạnh (Cryo-Transmission Electron Microscopy – Cryo-TEM)

Cryo-TEM là một kỹ thuật hiển vi điện tử truyền qua (TEM) chuyên biệt, trong đó mẫu vật sinh học được nghiên cứu ở nhiệt độ đông lạnh siêu lạnh (cryogenic temperatures), thường là nhiệt độ nitơ lỏng (-196°C hoặc 77K). Kỹ thuật này cho phép quan sát các mẫu vật sinh học ở trạng thái gần với tự nhiên nhất, tránh được các tác động do các quá trình chuẩn bị mẫu truyền thống như nhuộm màu, cố định hóa học, hay sấy khô. Việc bảo tồn cấu trúc tự nhiên của mẫu vật ở trạng thái đông lạnh cho phép nghiên cứu các phân tử sinh học, phức hợp protein và thậm chí cả tế bào ở độ phân giải gần như nguyên tử.

Nguyên lý hoạt động

Cryo-TEM hoạt động dựa trên nguyên lý tương tự như TEM truyền thống, sử dụng một chùm electron năng lượng cao chiếu xuyên qua mẫu vật mỏng. Sự tương tác giữa electron và mẫu vật tạo ra hình ảnh phóng đại của cấu trúc bên trong mẫu. Tuy nhiên, điểm khác biệt chính của Cryo-TEM nằm ở việc chuẩn bị và quan sát mẫu ở trạng thái đông lạnh. Quá trình này bao gồm hai bước chính:

Đóng lạnh nhanh: Mẫu vật được đóng lạnh nhanh chóng trong ethane lỏng. Quá trình này diễn ra cực nhanh (tốc độ làm lạnh khoảng 10⁴ – 10⁶ K/s) để nước trong mẫu vật không kịp hình thành tinh thể băng lớn, mà thay vào đó tạo thành dạng băng vô định hình (vitreous ice), giống như một lớp kính bao quanh mẫu vật. Băng vô định hình giúp bảo tồn cấu trúc tự nhiên của mẫu vật, tránh sự biến dạng do tinh thể băng gây ra.

Quan sát ở nhiệt độ thấp: Mẫu vật đông lạnh được duy trì ở nhiệt độ cryogenic trong suốt quá trình quan sát dưới kính hiển vi điện tử. Điều này giúp giảm thiểu tối đa sự phá hủy mẫu do chùm electron gây ra. Một giá đỡ mẫu vật chuyên dụng được sử dụng để giữ mẫu vật ở nhiệt độ nitơ lỏng trong quá trình chụp ảnh.

Ưu điểm của Cryo-TEM

Cryo-TEM mang lại nhiều ưu điểm vượt trội so với các kỹ thuật hiển vi điện tử truyền thống:

Bảo tồn cấu trúc tự nhiên: Quan sát mẫu ở trạng thái đông lạnh gần với tự nhiên giúp giữ nguyên cấu trúc ba chiều của các phân tử sinh học, tránh được các biến dạng do các phương pháp chuẩn bị mẫu truyền thống gây ra. Điều này đặc biệt quan trọng đối với các cấu trúc nhạy cảm với môi trường như protein màng.
Độ phân giải cao: Cryo-TEM có khả năng đạt được độ phân giải ở mức nguyên tử (đến vài Ångström), cho phép quan sát chi tiết các cấu trúc phức tạp của protein, virus, và các đại phân tử sinh học khác.
Nghiên cứu các mẫu vật ngậm nước: Cryo-TEM cho phép nghiên cứu các mẫu vật sinh học trong môi trường ngậm nước, gần với điều kiện sinh lý tự nhiên.

Ứng dụng của Cryo-TEM

Cryo-TEM được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực nghiên cứu sinh học, bao gồm:

Xác định cấu trúc 3D của protein và phức hợp protein: Cryo-TEM kết hợp với kỹ thuật xử lý hình ảnh (image processing) cho phép xây dựng mô hình 3D của các phân tử sinh học ở độ phân giải cao. Phương pháp này được gọi là single-particle analysis.
Nghiên cứu cấu trúc virus: Cryo-TEM giúp quan sát cấu trúc chi tiết của virus, bao gồm vỏ protein, vật liệu di truyền, và các thành phần khác. Điều này rất quan trọng cho việc phát triển vaccine và thuốc kháng virus.
Nghiên cứu cấu trúc tế bào: Cryo-TEM tomography (Cryo-ET) cho phép tái tạo lại cấu trúc 3D của toàn bộ tế bào hoặc các bào quan ở độ phân giải cao. Kỹ thuật này cung cấp cái nhìn sâu sắc về tổ chức bên trong tế bào.
Phát triển thuốc: Cryo-TEM được sử dụng để nghiên cứu tương tác giữa thuốc và mục tiêu sinh học, hỗ trợ quá trình phát triển thuốc mới.

Hạn chế của Cryo-TEM

Mặc dù có nhiều ưu điểm, Cryo-TEM cũng gặp một số hạn chế:

Chuẩn bị mẫu phức tạp: Quá trình đóng lạnh nhanh đòi hỏi kỹ thuật cao và thiết bị chuyên dụng.
Chi phí cao: Cryo-TEM là một kỹ thuật đắt tiền, bao gồm cả chi phí thiết bị và vận hành.
Độ tương phản thấp: Hình ảnh Cryo-TEM thường có độ tương phản thấp, đòi hỏi kỹ thuật xử lý hình ảnh phức tạp.

Cryo-TEM: Các khía cạnh kỹ thuật bổ sung và xử lý hình ảnh

Sau khi mẫu được đóng lạnh nhanh và duy trì ở nhiệt độ cryogenic, quá trình chụp ảnh dưới kính hiển vi điện tử diễn ra. Một số khía cạnh kỹ thuật quan trọng cần lưu ý:

Độ dày mẫu: Mẫu vật cho Cryo-TEM cần phải rất mỏng (thường dưới 500nm) để chùm electron có thể xuyên qua. Kỹ thuật phổ biến để tạo ra mẫu mỏng là cryo-sectioning hoặc cryo-focused ion beam (FIB) milling. Cryo-sectioning sử dụng một microtome đặc biệt để cắt mẫu vật đông lạnh thành các lát mỏng, trong khi cryo-FIB sử dụng chùm ion hội tụ để làm mỏng mẫu.
Thiệt hại do chùm electron: Mặc dù quan sát ở nhiệt độ thấp giúp giảm thiểu thiệt hại do chùm electron, nhưng vẫn cần kiểm soát liều lượng electron chiếu vào mẫu để tránh phá hủy cấu trúc. Kỹ thuật low-dose microscopy được sử dụng để giảm thiểu liều lượng electron.
Drift: Mẫu vật có thể bị dịch chuyển (drift) trong quá trình chụp ảnh, ảnh hưởng đến độ phân giải của hình ảnh. Các hệ thống Cryo-TEM hiện đại được trang bị bộ phận điều khiển drift để giảm thiểu hiện tượng này. Ngoài ra, các thuật toán xử lý hình ảnh cũng được sử dụng để hiệu chỉnh drift.

Xử lý hình ảnh

Hình ảnh Cryo-TEM thường có độ tương phản thấp và chứa nhiều nhiễu. Do đó, cần phải xử lý hình ảnh để tăng cường độ tương phản và loại bỏ nhiễu. Các bước xử lý hình ảnh bao gồm:

Hiệu chỉnh drift: Sử dụng các thuật toán để bù lại sự dịch chuyển của mẫu vật trong quá trình chụp ảnh. Các phần mềm chuyên dụng như MotionCor2 được sử dụng phổ biến cho việc này.
Trung bình hóa hình ảnh (Image averaging): Kết hợp nhiều hình ảnh của các phân tử giống nhau để tăng cường tỷ lệ tín hiệu trên nhiễu và cải thiện độ phân giải. Kỹ thuật này tận dụng tính đối xứng của các phân tử để tạo ra hình ảnh trung bình chính xác hơn.
Phân loại hình ảnh (Image classification): Phân loại các hình ảnh dựa trên sự khác biệt về cấu trúc để xác định các cấu trúc khác nhau của phân tử. Điều này giúp phân tách các cấu trúc khác nhau của một phân tử, ví dụ như các trạng thái khác nhau của một protein.
Tái tạo 3D (3D reconstruction): Sử dụng các thuật toán để xây dựng mô hình 3D của phân tử từ các hình ảnh 2D chụp ở các góc nhìn khác nhau. Phương pháp phổ biến là single-particle analysis cho phân tích các phân tử riêng lẻ và cryo-electron tomography (cryo-ET) cho phân tích các cấu trúc lớn hơn như tế bào và bào quan.

Các dạng Cryo-TEM

Ngoài Cryo-TEM truyền thống, còn có một số biến thể của kỹ thuật này:

Cryo-electron tomography (Cryo-ET): Cho phép tái tạo lại cấu trúc 3D của toàn bộ tế bào hoặc các bào quan ở độ phân giải cao bằng cách chụp một loạt hình ảnh 2D của mẫu vật ở các góc nghiêng khác nhau.
Single-particle analysis: Kỹ thuật này sử dụng hình ảnh của hàng ngàn phân tử riêng lẻ để tái tạo lại cấu trúc 3D của phân tử.
MicroED (Micro Electron Diffraction): Kỹ thuật nhiễu xạ electron trên tinh thể nano hoặc micro được đông lạnh, cho phép xác định cấu trúc của các phân tử khó kết tinh. Phương pháp này sử dụng tinh thể nhỏ hơn nhiều so với nhiễu xạ tia X truyền thống.

So sánh Cryo-TEM với các kỹ thuật khác

Cryo-TEM có nhiều ưu điểm so với các kỹ thuật hiển vi khác như kính hiển vi điện tử quét (SEM) hay kính hiển vi quang học. Cryo-TEM cho phép quan sát các mẫu vật sinh học ở trạng thái gần với tự nhiên nhất và đạt được độ phân giải cao hơn. Tuy nhiên, Cryo-TEM cũng có một số hạn chế như chi phí cao và chuẩn bị mẫu phức tạp. So với NMR, Cryo-TEM có thể nghiên cứu các phân tử lớn hơn và phức tạp hơn. So với nhiễu xạ tia X, Cryo-TEM không yêu cầu tinh thể lớn, nhưng đòi hỏi kỹ thuật xử lý hình ảnh phức tạp hơn.

Tóm tắt về Kính hiển vi điện tử quét truyền qua lạnh

Cryo-TEM, hay kính hiển vi điện tử truyền qua lạnh, là một kỹ thuật mạnh mẽ cho phép quan sát các mẫu vật sinh học ở trạng thái gần với tự nhiên nhất. Điểm mấu chốt của kỹ thuật này là quá trình đông lạnh nhanh mẫu vật trong ethane lỏng, tạo thành băng vô định hình và ngăn chặn sự hình thành tinh thể băng phá hủy cấu trúc mẫu. Việc duy trì mẫu ở nhiệt độ cryogenic trong suốt quá trình quan sát cũng rất quan trọng để giảm thiểu thiệt hại do chùm electron gây ra.

Ưu điểm nổi bật nhất của Cryo-TEM là khả năng bảo tồn cấu trúc tự nhiên của mẫu vật và đạt được độ phân giải cao, thậm chí ở mức nguyên tử. Điều này cho phép các nhà nghiên cứu quan sát chi tiết cấu trúc 3D của protein, virus, và các đại phân tử sinh học khác trong môi trường ngậm nước, gần với điều kiện sinh lý. Chính vì vậy, Cryo-TEM đã trở thành công cụ không thể thiếu trong nhiều lĩnh vực nghiên cứu sinh học, từ xác định cấu trúc protein đến nghiên cứu virus và phát triển thuốc.

Tuy nhiên, cần lưu ý rằng Cryo-TEM cũng có một số hạn chế. Quá trình chuẩn bị mẫu phức tạp và đòi hỏi kỹ thuật cao. Chi phí vận hành và đầu tư thiết bị cũng khá cao. Hơn nữa, hình ảnh Cryo-TEM thường có độ tương phản thấp, cần phải xử lý hình ảnh phức tạp bằng các kỹ thuật như hiệu chỉnh drift, trung bình hóa hình ảnh, phân loại hình ảnh và tái tạo 3D để thu được thông tin hữu ích. Các kỹ thuật như single-particle analysis và cryo-electron tomography (cryo-ET) đóng vai trò quan trọng trong việc phân tích và tái tạo 3D cấu trúc của các phân tử sinh học từ dữ liệu Cryo-TEM.

Tài liệu tham khảo:

Frank, J. (2006). Three-dimensional electron microscopy of macromolecular assemblies: visualization of biological molecules in their native state. Oxford University Press.
Cheng, Y., Grigorieff, N., Penczek, P. A., & Walz, T. (2015). A primer to single-particle cryo-electron microscopy. Cell, 161(3), 438-449.
Kühlbrandt, W. (2014). Cryo-EM enters a new era. eLife, 3, e03678.

Câu hỏi và Giải đáp

Tại sao việc hình thành băng vô định hình lại quan trọng trong Cryo-TEM?

Trả lời: Băng tinh thể, với cấu trúc phân tử nước được sắp xếp theo trật tự, có thể làm biến dạng cấu trúc của mẫu vật sinh học. Băng vô định hình, với cấu trúc phân tử nước không có trật tự, giúp bảo tồn cấu trúc tự nhiên của mẫu vật ở trạng thái gần giống với trạng thái sống, cho phép quan sát chính xác hơn dưới kính hiển vi điện tử.

Kỹ thuật single-particle analysis hoạt động như thế nào trong Cryo-TEM?

Trả lời: Single-particle analysis sử dụng hàng ngàn, thậm chí hàng triệu hình ảnh 2D của các phân tử giống nhau được chụp từ các góc nhìn ngẫu nhiên. Các thuật toán xử lý hình ảnh sẽ phân loại, căn chỉnh và kết hợp các hình ảnh này để tái tạo lại cấu trúc 3D của phân tử.

Sự khác biệt chính giữa Cryo-TEM và TEM truyền thống là gì?

Trả lời: Sự khác biệt chính nằm ở việc chuẩn bị mẫu. TEM truyền thống thường yêu cầu các bước chuẩn bị mẫu như nhuộm màu, cố định hóa học và sấy khô, có thể làm biến dạng cấu trúc mẫu. Cryo-TEM sử dụng kỹ thuật đông lạnh nhanh để bảo tồn cấu trúc tự nhiên của mẫu vật ở trạng thái gần với trạng thái sống.

Độ phân giải của Cryo-TEM có thể đạt đến mức nào?

Trả lời: Cryo-TEM hiện đại có thể đạt được độ phân giải ở mức nguyên tử (dưới 0.2 nm), cho phép quan sát chi tiết các cấu trúc phức tạp của các phân tử sinh học.

Những thách thức nào cần được vượt qua để Cryo-TEM trở nên dễ tiếp cận hơn với các nhà nghiên cứu?

Trả lời: Một số thách thức bao gồm: chi phí cao của thiết bị và vận hành, quá trình chuẩn bị mẫu phức tạp đòi hỏi kỹ thuật cao, và việc xử lý dữ liệu hình ảnh lớn đòi hỏi sức mạnh tính toán đáng kể. Việc phát triển các quy trình tự động hóa và giảm chi phí sẽ giúp Cryo-TEM trở nên dễ tiếp cận hơn với cộng đồng nghiên cứu rộng lớn.

Một số điều thú vị về Kính hiển vi điện tử quét truyền qua lạnh

Giải Nobel Hóa học năm 2017: Ba nhà khoa học Jacques Dubochet, Joachim Frank và Richard Henderson đã được trao giải Nobel Hóa học năm 2017 cho công trình phát triển Cryo-TEM. Công trình của họ đã cách mạng hóa lĩnh vực sinh học cấu trúc, cho phép xác định cấu trúc 3D của các phân tử sinh học ở độ phân giải nguyên tử.
Hình dung virus Zika: Cryo-TEM đã đóng vai trò quan trọng trong việc xác định cấu trúc chi tiết của virus Zika, giúp các nhà khoa học hiểu rõ hơn về cơ chế lây nhiễm và phát triển các phương pháp điều trị hiệu quả.
Từ “băng vô định hình” (vitreous ice): Loại băng được hình thành trong quá trình đông lạnh nhanh của Cryo-TEM không giống như băng thông thường mà chúng ta thấy hàng ngày. Nó ở trạng thái vô định hình, nghĩa là các phân tử nước không sắp xếp theo một cấu trúc tinh thể cụ thể. Điều này rất quan trọng để bảo tồn cấu trúc tự nhiên của mẫu vật sinh học.
Hàng triệu hình ảnh: Để tái tạo lại cấu trúc 3D của một phân tử sinh học bằng kỹ thuật single-particle analysis, các nhà khoa học cần phân tích hàng triệu hình ảnh của các phân tử riêng lẻ chụp từ các góc nhìn khác nhau. Việc xử lý lượng dữ liệu khổng lồ này đòi hỏi sức mạnh tính toán rất lớn.
Cryo-TEM giúp nhìn thấy “máy móc phân tử”: Nhờ Cryo-TEM, chúng ta có thể quan sát các “máy móc phân tử” phức tạp bên trong tế bào, chẳng hạn như ribosome – nơi tổng hợp protein, hay proteasome – nơi phân giải protein. Việc hiểu rõ cơ chế hoạt động của các máy móc này rất quan trọng cho việc nghiên cứu các quá trình sinh học cơ bản và phát triển các phương pháp điều trị bệnh.
“Phim” phân tử: Các nhà khoa học đang phát triển kỹ thuật time-resolved Cryo-TEM, cho phép chụp ảnh các phân tử sinh học ở các thời điểm khác nhau trong một quá trình động. Điều này giống như quay “phim” về hoạt động của các phân tử, mở ra những khả năng mới trong việc nghiên cứu các quá trình sinh học động.