Kính hiển vi huỳnh quang (Fluorescence microscopy)

Nguyên lý hoạt động

Nguyên lý hoạt động của kính hiển vi huỳnh quang dựa trên hiện tượng huỳnh quang, quá trình mà một phân tử hấp thụ ánh sáng ở một bước sóng (kích thích) và sau đó phát ra ánh sáng ở bước sóng dài hơn (phát xạ). Quá trình này được thực hiện qua các bước sau:

1. Kích thích: Một nguồn sáng cường độ cao (thường là đèn hồ quang hoặc laser) phát ra ánh sáng kích thích ở một bước sóng cụ thể. Ánh sáng này đi qua một bộ lọc kích thích, chỉ cho phép ánh sáng ở bước sóng kích thích mong muốn đi qua, loại bỏ các bước sóng không mong muốn.
2. Huỳnh quang: Ánh sáng kích thích chiếu vào mẫu vật, nơi nó được hấp thụ bởi các fluorophores. Các fluorophores này sau đó phát ra ánh sáng huỳnh quang ở một bước sóng dài hơn (năng lượng thấp hơn). Sự dịch chuyển bước sóng này được gọi là dịch chuyển Stokes.
3. Lọc phát xạ: Ánh sáng phát ra từ mẫu vật đi qua một bộ lọc phát xạ. Bộ lọc này ngăn chặn ánh sáng kích thích và chỉ cho phép ánh sáng huỳnh quang ở bước sóng mong muốn đi qua, đảm bảo chỉ tín hiệu huỳnh quang được ghi lại.
4. Phát hiện: Ánh sáng huỳnh quang được phát hiện bởi một bộ cảm biến (thường là một camera CCD hoặc PMT), và hình ảnh được tạo ra. Tín hiệu huỳnh quang được chuyển đổi thành tín hiệu điện tử, sau đó được xử lý để tạo ra hình ảnh hiển thị vị trí và cường độ của các fluorophores trong mẫu.

Các thành phần chính

Kính hiển vi huỳnh quang bao gồm các thành phần chính sau:

• Nguồn sáng: Đèn hồ quang (như đèn thủy ngân, đèn xenon) hoặc laser cung cấp ánh sáng kích thích cường độ cao. Laser thường được ưa chuộng hơn do tính đơn sắc và cường độ cao.
• Bộ lọc kích thích: Chọn bước sóng kích thích phù hợp với fluorophore được sử dụng. Bộ lọc này chỉ cho phép ánh sáng ở bước sóng kích thích đi qua.
• Bộ lọc phát xạ: Chọn bước sóng phát xạ của fluorophore. Bộ lọc này chỉ cho phép ánh sáng huỳnh quang phát ra từ mẫu vật đi qua.
• Gương lưỡng sắc: Phản xạ ánh sáng kích thích về phía mẫu vật và truyền ánh sáng phát xạ về phía bộ cảm biến. Đây là một thành phần quan trọng để tách ánh sáng kích thích và phát xạ.
• Vật kính: Tập trung ánh sáng kích thích vào mẫu vật và thu thập ánh sáng phát xạ. Vật kính có độ phóng đại cao và khẩu độ số lớn là cần thiết để thu thập đủ ánh sáng huỳnh quang.
• Bộ cảm biến: Phát hiện ánh sáng huỳnh quang và tạo ra hình ảnh. Thường sử dụng camera CCD hoặc PMT (photomultiplier tube) để chuyển đổi ánh sáng thành tín hiệu điện tử.

Ứng dụng

Kính hiển vi huỳnh quang được sử dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực, bao gồm:

• Sinh học: Nghiên cứu cấu trúc tế bào, phân bố protein, tương tác protein-protein, quá trình vận chuyển nội bào, quá trình chết tế bào (apoptosis), hình ảnh tế bào sống, và nhiều ứng dụng khác.
• Y học: Chẩn đoán bệnh, nghiên cứu mô bệnh học, theo dõi điều trị, và phát triển thuốc mới. Ví dụ, kính hiển vi huỳnh quang được sử dụng để phát hiện các tế bào ung thư.
• Khoa học vật liệu: Nghiên cứu tính chất của vật liệu nano, polymer, và các vật liệu khác. Kính hiển vi huỳnh quang có thể được sử dụng để quan sát sự phân bố của các hạt nano trong vật liệu.

Ưu điểm

Kính hiển vi huỳnh quang mang lại nhiều ưu điểm so với các kỹ thuật hiển vi quang học khác:

• Độ nhạy cao: Có thể phát hiện các phân tử ở nồng độ rất thấp, nhờ khả năng khuếch đại tín hiệu huỳnh quang.
• Độ đặc hiệu cao: Có thể phân biệt các phân tử khác nhau bằng cách sử dụng các fluorophores khác nhau với các bước sóng kích thích và phát xạ đặc trưng.
• Hình ảnh nhiều màu: Cho phép đồng thời quan sát nhiều phân tử khác nhau trong cùng một mẫu vật bằng cách sử dụng các fluorophores với màu sắc khác nhau. Điều này rất hữu ích cho việc nghiên cứu tương tác giữa các phân tử khác nhau.

Nhược điểm

Mặc dù có nhiều ưu điểm, kính hiển vi huỳnh quang cũng có một số nhược điểm cần lưu ý:

• Photobleaching: Sự mờ dần của huỳnh quang theo thời gian do tiếp xúc với ánh sáng kích thích. Điều này hạn chế thời gian quan sát và có thể ảnh hưởng đến độ chính xác của các phép đo định lượng.
• Phototoxicity: Ánh sáng kích thích, đặc biệt là ở cường độ cao hoặc bước sóng ngắn, có thể gây độc cho tế bào sống, ảnh hưởng đến chức năng và thậm chí gây chết tế bào.
• Chi phí: Kính hiển vi huỳnh quang thường đắt hơn kính hiển vi truyền thống do yêu cầu nguồn sáng mạnh, bộ lọc quang học phức tạp và hệ thống phát hiện nhạy.

Một số công thức liên quan

Mối quan hệ giữa năng lượng ($E$), bước sóng ($\lambda$) và tần số ($f$) của ánh sáng:

$E = hf = \frac{hc}{\lambda}$

Trong đó:

• $h$ là hằng số Planck (6.626 x 10^-34 J.s).
• $c$ là tốc độ ánh sáng (3 x 10⁸ m/s).

Các kỹ thuật huỳnh quang nâng cao

Kính hiển vi huỳnh quang đã phát triển vượt bậc với nhiều kỹ thuật nâng cao cho phép cải thiện độ phân giải, giảm nhiễu nền và cung cấp thông tin chi tiết hơn về mẫu vật. Một số kỹ thuật đáng chú ý bao gồm:

• Kính hiển vi cộng hưởng huỳnh quang (FRAP – Fluorescence Recovery After Photobleaching): Kỹ thuật này sử dụng laser cường độ cao để tẩy trắng huỳnh quang một vùng nhỏ trong mẫu. Sự phục hồi huỳnh quang theo thời gian được đo lường để nghiên cứu sự khuếch tán và vận động của các phân tử.
• Kính hiển vi chuyển năng lượng cộng hưởng huỳnh quang (FRET – Förster Resonance Energy Transfer): FRET là một kỹ thuật nghiên cứu tương tác giữa hai phân tử huỳnh quang. Khi hai phân tử này ở gần nhau (thường trong khoảng 1-10 nm), năng lượng kích thích từ phân tử cho (donor) có thể được chuyển sang phân tử nhận (acceptor), dẫn đến sự phát xạ huỳnh quang từ phân tử nhận.
• Kính hiển vi toàn phần (Confocal Microscopy): Kỹ thuật này sử dụng một lỗ nhỏ (pinhole) để loại bỏ ánh sáng ngoài tiêu điểm, dẫn đến hình ảnh có độ phân giải cao hơn và giảm nhiễu nền, đặc biệt là khi quan sát các mẫu dày.
• Kính hiển vi siêu phân giải (Super-resolution Microscopy): Các kỹ thuật siêu phân giải như PALM (Photoactivated Localization Microscopy) và STORM (Stochastic Optical Reconstruction Microscopy) vượt qua giới hạn nhiễu xạ của ánh sáng, cho phép quan sát các cấu trúc với độ phân giải nanomet.
• Kính hiển vi hai photon (Two-photon Microscopy): Kỹ thuật này sử dụng hai photon năng lượng thấp để kích thích huỳnh quang. Điều này giảm thiểu photobleaching và phototoxicity, đồng thời cho phép hình ảnh sâu hơn vào trong các mẫu dày.

Fluorophores thường được sử dụng

Sự lựa chọn fluorophore phụ thuộc vào ứng dụng cụ thể. Một số fluorophores phổ biến bao gồm:

• GFP (Green Fluorescent Protein): Protein huỳnh quang xanh lá cây, được sử dụng rộng rãi trong sinh học tế bào và phân tử.
• RFP (Red Fluorescent Protein): Protein huỳnh quang đỏ. Có nhiều biến thể của RFP với các màu sắc khác nhau.
• DAPI (4′,6-diamidino-2-phenylindole): Nhuộm huỳnh quang liên kết với DNA, được sử dụng để nhuộm nhân tế bào.
• FITC (Fluorescein isothiocyanate): Fluorophore phổ biến được sử dụng để gắn nhãn kháng thể.
• Texas Red: Fluorophore phát xạ màu đỏ.

Chuẩn bị mẫu

Việc chuẩn bị mẫu cho kính hiển vi huỳnh quang rất quan trọng để có được hình ảnh chất lượng cao. Các bước chuẩn bị mẫu có thể bao gồm cố định, permeabilization (tạo lỗ trên màng tế bào), blocking (chặn các vị trí liên kết không đặc hiệu), và nhuộm với fluorophores. Quá trình chuẩn bị mẫu cần được tối ưu hóa cho từng ứng dụng cụ thể để đảm bảo tín hiệu huỳnh quang mạnh và giảm thiểu nhiễu nền.

• Molecular Biology of the Cell – Alberts B, Johnson A, Lewis J, et al.
• Principles of Fluorescence Spectroscopy – Lakowicz JR.
• Handbook of Biological Confocal Microscopy – Pawley JB (ed.).

Câu hỏi và Giải đáp

Làm thế nào để lựa chọn fluorophore phù hợp cho một ứng dụng cụ thể trong kính hiển vi huỳnh quang?

Trả lời: Việc lựa chọn fluorophore phụ thuộc vào nhiều yếu tố, bao gồm:

• Bước sóng kích thích và phát xạ: Cần chọn fluorophore có bước sóng kích thích phù hợp với nguồn sáng của kính hiển vi và bước sóng phát xạ nằm trong khoảng phát hiện của bộ cảm biến.
• Độ sáng: Fluorophore sáng hơn sẽ cho tín hiệu mạnh hơn, giúp dễ dàng quan sát và phân tích.
• Độ bền quang: Fluorophore có độ bền quang cao sẽ ít bị photobleaching, cho phép quan sát trong thời gian dài hơn.
• Môi trường: Một số fluorophore hoạt động tốt hơn trong môi trường nước, trong khi một số khác lại phù hợp với môi trường kỵ nước.
• Ứng dụng: Ví dụ, FRET yêu cầu hai fluorophore có phổ phát xạ và kích thích chồng chéo lên nhau.

Photobleaching là gì và làm thế nào để giảm thiểu ảnh hưởng của nó?

Trả lời: Photobleaching là hiện tượng mất dần huỳnh quang của fluorophore do tiếp xúc kéo dài với ánh sáng kích thích. Có thể giảm thiểu photobleaching bằng cách:

• Giảm cường độ ánh sáng kích thích.
• Giảm thời gian phơi sáng.
• Sử dụng fluorophore chống photobleaching.
• Sử dụng môi trường gắn kết chống phai màu.
• Áp dụng các kỹ thuật hình ảnh như kính hiển vi đồng tiêu hoặc hai photon.

Sự khác biệt chính giữa kính hiển vi đồng tiêu và kính hiển vi huỳnh quang thông thường là gì?

Trả lời: Kính hiển vi đồng tiêu sử dụng một pinhole để loại bỏ ánh sáng ngoài tiêu điểm, giúp cải thiện độ phân giải và giảm nhiễu nền, đặc biệt là khi quan sát các mẫu dày. Kính hiển vi huỳnh quang thông thường không có pinhole, dẫn đến hình ảnh mờ hơn và nhiễu nền cao hơn ở các mẫu dày.

Kính hiển vi chuyển năng lượng cộng hưởng huỳnh quang (FRET) được sử dụng để nghiên cứu điều gì?

Trả lời: FRET được sử dụng để nghiên cứu tương tác giữa hai phân tử. Khi hai phân tử được gắn nhãn với các fluorophore phù hợp ở gần nhau (thường là trong khoảng 1-10 nm), năng lượng kích thích từ fluorophore cho (donor) có thể được chuyển sang fluorophore nhận (acceptor), dẫn đến sự phát xạ huỳnh quang từ acceptor. Điều này cho phép nghiên cứu các tương tác như liên kết protein-protein, gấp protein và các thay đổi cấu trúc phân tử.

Nguyên lý hoạt động của kính hiển vi hai photon là gì và ưu điểm của nó so với kính hiển vi huỳnh quang một photon là gì?

Trả lời: Kính hiển vi hai photon sử dụng hai photon năng lượng thấp, có bước sóng dài hơn, để đồng thời kích thích fluorophore. Hai photon này cần phải tương tác với fluorophore gần như cùng lúc. Điều này chỉ xảy ra ở tiêu điểm của laser, do đó giảm thiểu kích thích ngoài tiêu điểm và photobleaching. Ưu điểm của kính hiển vi hai photon bao gồm:

• Độ xuyên sâu tốt hơn vào mẫu vật dày.
• Giảm photobleaching và phototoxicity.
• Hình ảnh 3D tốt hơn.