Kính hiển vi (Microscopy)

Nguyên lý hoạt động

Kính hiển vi hoạt động dựa trên nguyên lý sử dụng một hoặc nhiều thấu kính để phóng to hình ảnh của vật thể. Ánh sáng hoặc chùm electron tương tác với mẫu vật và sau đó được thấu kính hội tụ để tạo ra một hình ảnh phóng đại. Độ phóng đại của kính hiển vi được tính bằng tích của độ phóng đại của vật kính và thị kính. Có nhiều loại kính hiển vi khác nhau, mỗi loại sử dụng một nguyên lý tương tác khác nhau giữa mẫu vật và nguồn chiếu sáng (ánh sáng khả kiến, tia electron, tia X,…) để tạo ra hình ảnh. Ví dụ, kính hiển vi quang học sử dụng ánh sáng khả kiến, trong khi kính hiển vi điện tử sử dụng chùm electron.

$Độ_phóng_đại_tổng = Độ_phóng_đại_vật_kính \times Độ_phóng_đại_thị_kính$

Một yếu tố quan trọng khác ngoài độ phóng đại là độ phân giải, được định nghĩa là khoảng cách nhỏ nhất giữa hai điểm trên mẫu vật mà vẫn có thể phân biệt được trên hình ảnh. Độ phân giải càng cao thì hình ảnh càng chi tiết và rõ nét.

Các loại kính hiển vi

Có nhiều loại kính hiển vi khác nhau, mỗi loại sử dụng một nguyên lý khác nhau để tạo ra hình ảnh phóng đại. Một số loại kính hiển vi phổ biến bao gồm:

• Kính hiển vi quang học: Sử dụng ánh sáng khả kiến để chiếu sáng mẫu vật. Đây là loại kính hiển vi phổ biến nhất và thường được sử dụng trong các phòng thí nghiệm sinh học, y tế và giáo dục. Kính hiển vi quang học có thể được chia thành nhiều loại nhỏ hơn như kính hiển vi trường sáng, trường tối, tương phản pha, huỳnh quang… Kính hiển vi trường sáng là loại cơ bản nhất, tạo ra hình ảnh bằng cách truyền ánh sáng qua mẫu vật. Kính hiển vi trường tối làm nổi bật các cấu trúc nhỏ bằng cách chiếu sáng mẫu từ một góc xiên và chỉ thu thập ánh sáng bị tán xạ. Kính hiển vi tương phản pha tăng cường độ tương phản của hình ảnh bằng cách khai thác sự lệch pha của ánh sáng khi đi qua các vùng có chiết suất khác nhau. Kính hiển vi huỳnh quang sử dụng các chất nhuộm huỳnh quang để làm nổi bật các cấu trúc cụ thể.
• Kính hiển vi điện tử: Sử dụng chùm electron để chiếu sáng mẫu vật. Kính hiển vi điện tử có độ phân giải cao hơn nhiều so với kính hiển vi quang học, cho phép quan sát các cấu trúc nhỏ hơn nhiều, như virus và thậm chí cả nguyên tử. Có hai loại kính hiển vi điện tử chính: kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM) và kính hiển vi điện tử quét (SEM). TEM tạo ra hình ảnh bằng cách truyền chùm electron qua mẫu vật mỏng, trong khi SEM quét bề mặt mẫu vật bằng chùm electron và thu thập các electron thứ cấp hoặc phản xạ để tạo ra hình ảnh 3D.
• Kính hiển vi lực nguyên tử (AFM): Sử dụng một đầu dò nhỏ để quét bề mặt của mẫu vật và tạo ra hình ảnh ba chiều. AFM có thể được sử dụng để nghiên cứu các vật liệu ở cấp độ nano. AFM không sử dụng nguồn chiếu sáng như kính hiển vi quang học hay điện tử, mà dựa trên lực tương tác giữa đầu dò và bề mặt mẫu vật.
• Kính hiển vi quét xuyên hầm (STM): Sử dụng hiệu ứng đường hầm lượng tử để tạo ra hình ảnh bề mặt vật liệu ở cấp độ nguyên tử. STM cũng dựa trên tương tác ở cấp độ nano, nhưng sử dụng dòng điện chạy giữa đầu dò và mẫu vật để tạo ra hình ảnh.

Ứng dụng của kính hiển vi

Kính hiển vi được sử dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực khác nhau, bao gồm:

• Sinh học: Nghiên cứu tế bào, vi sinh vật, mô học…
• Y học: Chẩn đoán bệnh, nghiên cứu vi khuẩn, virus…
• Khoa học vật liệu: Nghiên cứu cấu trúc và tính chất của vật liệu.
• Kỹ thuật: Kiểm tra chất lượng sản phẩm, phân tích lỗi…
• Pháp y: Phân tích bằng chứng.
• Khảo cổ học: Nghiên cứu di vật cổ.

Các thông số quan trọng của kính hiển vi

• Độ phóng đại: Mức độ phóng to của hình ảnh.
• Độ phân giải: Khả năng phân biệt hai điểm riêng biệt gần nhau.
• Độ sâu trường ảnh: Khoảng cách giữa điểm gần nhất và điểm xa nhất trong mẫu mà vẫn còn nét.
• Độ tương phản: Sự khác biệt về cường độ sáng giữa các vùng khác nhau của hình ảnh.

Kính hiển vi là một công cụ quan trọng trong nhiều lĩnh vực khoa học và công nghệ. Sự phát triển của kính hiển vi đã góp phần to lớn vào sự hiểu biết của chúng ta về thế giới vi mô và nano.

Các bộ phận chính của kính hiển vi quang học

Mặc dù có nhiều loại kính hiển vi khác nhau, nhưng kính hiển vi quang học vẫn là loại phổ biến nhất. Dưới đây là các bộ phận chính của một kính hiển vi quang học điển hình:

• Thị kính (Eyepiece): Thấu kính mà người dùng nhìn vào để quan sát mẫu vật. Thị kính thường có độ phóng đại 10x. Một số kính hiển vi có thị kính kép, cho phép quan sát bằng cả hai mắt.
• Vật kính (Objective lens): Thấu kính nằm gần mẫu vật và có nhiệm vụ phóng đại hình ảnh ban đầu. Kính hiển vi thường có nhiều vật kính với độ phóng đại khác nhau (ví dụ: 4x, 10x, 40x, 100x). Vật kính 100x thường được sử dụng với dầu soi để tăng độ phân giải.
• Bàn đặt mẫu vật (Stage): Nơi đặt mẫu vật để quan sát. Bàn đặt mẫu vật thường có các kẹp để giữ mẫu vật cố định. Một số bàn đặt mẫu vật có thể di chuyển theo hai chiều để quan sát các vùng khác nhau của mẫu.
• Nguồn sáng (Light source): Cung cấp ánh sáng để chiếu sáng mẫu vật. Nguồn sáng có thể là đèn halogen, đèn LED hoặc gương phản xạ. Cường độ sáng có thể được điều chỉnh để tối ưu hóa hình ảnh.
• Tụ quang (Condenser): Hội tụ ánh sáng từ nguồn sáng vào mẫu vật. Tụ quang giúp điều chỉnh độ sáng và độ tương phản của hình ảnh. Kính hiển vi chất lượng cao thường có tụ quang Abbe, cho phép điều chỉnh chính xác hơn.
• Núm chỉnh tiêu cự (Focus knobs): Dùng để điều chỉnh khoảng cách giữa vật kính và mẫu vật để lấy nét hình ảnh. Có hai núm chỉnh tiêu cự: núm chỉnh thô (coarse focus) và núm chỉnh tinh (fine focus). Núm chỉnh thô dùng để điều chỉnh nhanh chóng, trong khi núm chỉnh tinh dùng để điều chỉnh chính xác.

Chuẩn bị mẫu vật

Việc chuẩn bị mẫu vật đúng cách là rất quan trọng để có được hình ảnh rõ nét dưới kính hiển vi. Một số kỹ thuật chuẩn bị mẫu vật phổ biến bao gồm:

• Làm tiêu bản: Đặt mẫu vật lên lam kính và phủ lên bằng lamen. Mẫu vật cần được trải mỏng và cố định trên lam kính.
• Nhuộm màu: Sử dụng các loại thuốc nhuộm để làm nổi bật các cấu trúc cụ thể của mẫu vật. Các loại thuốc nhuộm khác nhau sẽ nhuộm các cấu trúc khác nhau, giúp phân biệt các thành phần của tế bào hoặc mô.
• Cắt lát mỏng: Cắt mẫu vật thành các lát mỏng để quan sát cấu trúc bên trong. Kỹ thuật này thường được sử dụng trong mô học.

Kỹ thuật quan sát

Để quan sát mẫu vật hiệu quả, cần phải điều chỉnh đúng các thông số của kính hiển vi, bao gồm độ phóng đại, độ sáng và tiêu cự. Bắt đầu với vật kính có độ phóng đại thấp nhất và sau đó tăng dần độ phóng đại khi cần thiết.

An toàn khi sử dụng kính hiển vi

• Luôn mang kính bảo hộ khi sử dụng kính hiển vi.
• Cẩn thận khi xử lý các mẫu vật và hóa chất.
• Không chạm vào vật kính.
• Tắt nguồn điện sau khi sử dụng.
• Khi sử dụng vật kính 100x với dầu soi, cần lau sạch dầu sau khi sử dụng để tránh làm hỏng vật kính.

• Murphy, D. B. (2012). Fundamentals of light microscopy and electronic imaging. John Wiley & Sons.
• Goldstein, J. I., Newbury, D. E., Michael, J. R., Ritchie, N. W. M., Scott, J. H. J., & Joy, D. C. (2017). Scanning electron microscopy and X-ray microanalysis. Springer.
• Alberts, B., Johnson, A., Lewis, J., Raff, M., Roberts, K., & Walter, P. (2002). Molecular biology of the cell. Garland Science.

Câu hỏi và Giải đáp

Sự khác biệt chính giữa kính hiển vi quang học và kính hiển vi điện tử là gì?

Trả lời: Sự khác biệt chính nằm ở nguồn chiếu sáng. Kính hiển vi quang học sử dụng ánh sáng khả kiến, trong khi kính hiển vi điện tử sử dụng chùm electron. Điều này dẫn đến sự khác biệt lớn về độ phân giải. Kính hiển vi điện tử có độ phân giải cao hơn nhiều so với kính hiển vi quang học, cho phép quan sát các cấu trúc nhỏ hơn, như virus và thậm chí cả nguyên tử. Kính hiển vi quang học bị giới hạn bởi bước sóng của ánh sáng khả kiến, trong khi bước sóng của electron nhỏ hơn nhiều, cho phép độ phân giải cao hơn.

Độ sâu trường ảnh (Depth of Field) là gì và tại sao nó lại quan trọng trong kính hiển vi?

Trả lời: Độ sâu trường ảnh là khoảng cách giữa điểm gần nhất và điểm xa nhất trong mẫu mà vẫn còn nét khi quan sát dưới kính hiển vi. Nó quan trọng vì nó ảnh hưởng đến việc chúng ta có thể nhìn thấy rõ bao nhiêu chi tiết của mẫu vật, đặc biệt là với các mẫu vật ba chiều. Độ sâu trường ảnh lớn cho phép quan sát rõ nét nhiều lớp của mẫu cùng một lúc, trong khi độ sâu trường ảnh nhỏ chỉ cho phép quan sát rõ nét một lớp mỏng.

Làm thế nào để tính toán độ phóng đại tổng của kính hiển vi?

Trả lời: Độ phóng đại tổng của kính hiển vi được tính bằng tích của độ phóng đại của vật kính và độ phóng đại của thị kính.

$Độ_phóng_đại_tổng = Độ_phóng_đại_vật_kính \times Độ_phóng_đại_thị_kính$

Ví dụ, nếu vật kính có độ phóng đại 40x và thị kính có độ phóng đại 10x, thì độ phóng đại tổng là 40 x 10 = 400x.

Kỹ thuật nhuộm màu được sử dụng trong kính hiển vi như thế nào và tại sao nó lại quan trọng?

Trả lời: Kỹ thuật nhuộm màu sử dụng các loại thuốc nhuộm đặc biệt để làm nổi bật các cấu trúc cụ thể của mẫu vật. Nhiều mẫu vật sinh học gần như trong suốt dưới kính hiển vi quang học, việc nhuộm màu giúp tăng độ tương phản và làm cho các cấu trúc khác nhau dễ phân biệt hơn, ví dụ như nhuộm Gram để phân biệt vi khuẩn Gram dương và Gram âm.

Kính hiển vi lực nguyên tử (AFM) khác với kính hiển vi quang học và kính hiển vi điện tử như thế nào?

Trả lời: Kính hiển vi lực nguyên tử (AFM) không sử dụng ánh sáng hay chùm electron để tạo ảnh. Thay vào đó, nó sử dụng một đầu dò nhọn quét trên bề mặt mẫu vật. Lực tương tác giữa đầu dò và bề mặt được đo và sử dụng để tạo ra hình ảnh ba chiều của bề mặt. AFM có thể được sử dụng để nghiên cứu bề mặt của các vật liệu ở cấp độ nano, kể cả trong môi trường không chân không và chất lỏng, điều mà kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM) không thể làm được.