Kỹ thuật nuôi cấy tế bào (Cell Culture Techniques)

Phân loại

Có nhiều cách để phân loại kỹ thuật nuôi cấy tế bào, nhưng cách phổ biến nhất là dựa trên nguồn gốc và đặc tính của tế bào. Các loại chính bao gồm:

• Nuôi cấy sơ cấp (Primary Culture): Các tế bào được phân lập trực tiếp từ mô hoặc cơ quan của sinh vật và đưa vào nuôi cấy. Ưu điểm lớn nhất của nuôi cấy sơ cấp là các tế bào giữ lại được nhiều đặc tính sinh học và di truyền nguyên bản của mô *in vivo* (trong cơ thể sống). Tuy nhiên, chúng có tuổi thọ giới hạn và chỉ có thể phân chia một số lần nhất định trước khi đi vào quá trình lão hóa và chết (hiện tượng giới hạn Hayflick).
• Nuôi cấy tế bào dòng (Cell Line Culture): Khi các tế bào sơ cấp được cấy chuyền (subculture), chúng trở thành dòng tế bào hữu hạn (finite cell line) và vẫn có tuổi thọ giới hạn. Tuy nhiên, một số tế bào có thể trải qua quá trình biến đổi (transformation) hoặc bất tử hóa (immortalization), cho phép chúng phân chia vô hạn. Những dòng tế bào này được gọi là dòng tế bào liên tục (continuous cell line). Chúng rất hữu ích cho các nghiên cứu dài hạn do tính ổn định và khả năng cung cấp số lượng lớn tế bào đồng nhất, nhưng có thể đã thay đổi một số đặc tính so với tế bào gốc.
• Nuôi cấy 3D (3D Culture): Thay vì phát triển trên một bề mặt phẳng (2D), tế bào được nuôi trong một cấu trúc không gian ba chiều. Kỹ thuật này sử dụng các giá thể sinh học (scaffolds), hydrogel, hoặc các hệ thống giọt treo để tái tạo lại cấu trúc vi môi trường của mô trong cơ thể, cho phép các tương tác tế bào-tế bào và tế bào-chất nền ngoại bào phức tạp hơn, phản ánh chính xác hơn các đáp ứng sinh học.
• Nuôi cấy tế bào gốc (Stem Cell Culture): Đây là lĩnh vực chuyên biệt tập trung vào việc nuôi cấy các tế bào gốc – những tế bào có khả năng tự làm mới (self-renewal) và biệt hóa thành nhiều loại tế bào chuyên biệt khác nhau. Kỹ thuật này đòi hỏi môi trường và các yếu tố tăng trưởng đặc thù để duy trì “tính gốc” (stemness) hoặc để hướng chúng biệt hóa theo một dòng tế bào mong muốn.
• Nuôi cấy tế bào ung thư (Cancer Cell Culture): Hầu hết các dòng tế bào ung thư là các dòng tế bào liên tục, được phân lập từ các khối u. Chúng là công cụ vô giá trong nghiên cứu sinh học ung thư, sàng lọc thuốc chống ung thư và tìm hiểu các cơ chế phân tử của bệnh.
• Nuôi cấy tế bào thực vật (Plant Cell Culture): Kỹ thuật nuôi cấy các tế bào, mô (như mô phân sinh) hoặc cơ quan (như rễ, lá) của thực vật trong môi trường dinh dưỡng nhân tạo và điều kiện vô trùng. Do đặc tính toàn năng (totipotency) của tế bào thực vật, kỹ thuật này được ứng dụng rộng rãi trong nhân giống vô tính (vi nhân giống), sản xuất các hợp chất thứ cấp và cải thiện giống cây trồng.

Quy trình chung

Mặc dù quy trình có thể thay đổi tùy thuộc vào loại tế bào và mục đích nghiên cứu, các bước cơ bản trong nuôi cấy tế bào động vật thường bao gồm:

1. Chuẩn bị môi trường nuôi cấy: Môi trường là một dung dịch phức hợp cung cấp mọi thứ cần thiết cho sự phát triển của tế bào. Thành phần chính bao gồm:
   • Muối vô cơ: Duy trì áp suất thẩm thấu và cung cấp các ion thiết yếu (ví dụ: NaCl, KCl, $CaCl_2$).
   • Nguồn năng lượng: Thường là đường glucose ($C_6H_{12}O_6$).
   • Amino acid: Các đơn vị cơ bản để tế bào tổng hợp protein.
   • Vitamin: Đóng vai trò là co-factor cho các phản ứng enzyme.
   • Yếu tố tăng trưởng: Các protein tín hiệu kích thích sự sinh sản và biệt hóa (ví dụ: EGF, FGF).
   • Huyết thanh (Serum): Thường là Huyết thanh Bê Bào thai (FBS), là một hỗn hợp phức tạp chứa hormone, yếu tố tăng trưởng, và các protein gắn kết.
   • Hệ đệm (Buffer System): Thường là hệ đệm bicarbonate ($NaHCO_3$) kết hợp với nồng độ $CO_2$ 5-10% trong tủ ấm để duy trì độ pH ổn định (khoảng 7.2 – 7.4).
   • Kháng sinh và kháng nấm: (ví dụ: Penicillin, Streptomycin, Amphotericin B) để ngăn ngừa sự nhiễm tạp của vi sinh vật.
2. Phân lập tế bào (từ nuôi cấy sơ cấp): Tế bào được tách ra khỏi mô bằng phương pháp cơ học (băm nhỏ, nghiền) và/hoặc phương pháp enzyme (sử dụng trypsin, collagenase để phá vỡ chất nền ngoại bào và các liên kết giữa tế bào).
3. Gieo cấy tế bào (Seeding): Huyền phù tế bào được chuyển vào các dụng cụ nuôi cấy đã chứa sẵn môi trường.
4. Ủ tế bào (Incubation): Các bình nuôi cấy được đặt trong tủ ấm CO2, nơi duy trì các điều kiện tối ưu: nhiệt độ (thường là $37^\circ C$ cho tế bào động vật có vú), độ ẩm cao, và nồng độ $CO_2$ được kiểm soát.
5. Theo dõi và thay môi trường: Tế bào được kiểm tra hình thái và mật độ hàng ngày bằng kính hiển vi quang học ngược. Môi trường được thay định kỳ (thường là 2-3 ngày/lần) để cung cấp dinh dưỡng mới và loại bỏ các sản phẩm trao đổi chất độc hại.
6. Cấy chuyền (Subculturing/Passaging): Khi các tế bào bám dính phát triển và bao phủ gần hết bề mặt đáy bình (đạt độ hội lưu – confluence), chúng cần được tách ra và pha loãng để cấy sang các bình mới, tạo không gian cho chúng tiếp tục phát triển.
7. Đánh giá và phân tích: Tùy vào mục đích, các phân tích khác nhau có thể được thực hiện như đếm số lượng và xác định tỷ lệ tế bào sống, phân tích biểu hiện gen/protein, hoặc kiểm tra đáp ứng với thuốc.
8. Trữ lạnh (Cryopreservation): Tế bào có thể được đông lạnh và bảo quản lâu dài trong nitơ lỏng ($-196^\circ C$). Quá trình này đòi hỏi sử dụng các chất bảo quản lạnh (cryoprotectant) như DMSO (Dimethyl Sulfoxide) hoặc glycerol để ngăn chặn sự hình thành các tinh thể đá nội bào có thể làm vỡ màng tế bào.

Ứng dụng

Kỹ thuật nuôi cấy tế bào là một nền tảng không thể thiếu trong khoa học sự sống hiện đại, với các ứng dụng sâu rộng trong nhiều lĩnh vực:

• Nghiên cứu sinh học cơ bản: Cung cấp các hệ thống mô hình (*in vitro*) để nghiên cứu các quá trình sinh học cốt lõi như chu kỳ tế bào, truyền tín hiệu, apoptosis (chết tế bào theo chương trình), và các tương tác phân tử.
• Sản xuất dược phẩm sinh học: Các dòng tế bào động vật (ví dụ: tế bào buồng trứng chuột hamster Trung Quốc – CHO) được sử dụng như những “nhà máy” vi mô để sản xuất quy mô lớn các protein tái tổ hợp, bao gồm kháng thể đơn dòng, vaccine, và các hormone (như erythropoietin).
• Y học tái tạo và Kỹ thuật mô: Nuôi cấy tế bào gốc và các loại tế bào khác để tạo ra các mô hoặc cơ quan nhân tạo (ví dụ: da, sụn) nhằm mục đích cấy ghép, thay thế các mô bị tổn thương hoặc thoái hóa.
• Độc chất học và Sàng lọc thuốc: Sử dụng các dòng tế bào để đánh giá độc tính của hóa chất, mỹ phẩm và các hợp chất thuốc tiềm năng, giúp giảm thiểu đáng kể việc sử dụng động vật thí nghiệm theo nguyên tắc 3Rs (Replacement, Reduction, Refinement).
• Chẩn đoán y học: Đặc biệt trong virus học, mẫu bệnh phẩm từ bệnh nhân được cấy lên các dòng tế bào cảm thụ để phân lập, định danh và nghiên cứu virus. Kỹ thuật này cũng được dùng để chẩn đoán các rối loạn di truyền thông qua phân tích nhiễm sắc thể (karyotyping) từ tế bào nuôi cấy.
• Nghiên cứu ung thư: Các dòng tế bào ung thư là công cụ thiết yếu để tìm hiểu cơ chế phân tử của sự hình thành và phát triển khối u, di căn, và để sàng lọc, đánh giá hiệu quả của các liệu pháp chống ung thư mới.
• Nông nghiệp và Công nghệ sinh học thực vật: Nuôi cấy mô-tế bào thực vật được ứng dụng để nhân giống vô tính (vi nhân giống) với quy mô công nghiệp, tạo ra các giống cây sạch bệnh, cải tiến di truyền, và sản xuất các hợp chất thứ cấp có giá trị dược liệu.

Ưu điểm và Nhược điểm

Ưu điểm:

• Khả năng kiểm soát môi trường: Các thông số vật lý-hóa học (nhiệt độ, pH, áp suất thẩm thấu, nồng độ oxy) và các thành phần sinh học (yếu tố tăng trưởng, hormone) có thể được kiểm soát và điều chỉnh một cách chính xác.
• Tính đồng nhất và tái lặp: Các dòng tế bào cung cấp một quần thể tế bào đồng nhất về mặt di truyền, đảm bảo tính nhất quán và khả năng lặp lại kết quả giữa các thí nghiệm.
• Giảm thiểu sử dụng động vật: Cung cấp một giải pháp thay thế hiệu quả cho nhiều thí nghiệm trên động vật, phù hợp với các tiêu chuẩn đạo đức khoa học.
• Hiệu quả về chi phí và thời gian: So với các mô hình động vật phức tạp, nuôi cấy tế bào thường tiết kiệm chi phí, cho kết quả nhanh hơn và cho phép thực hiện các thử nghiệm sàng lọc thông lượng cao (high-throughput screening).

Nhược điểm:

• Mất các đặc tính *in vivo*: Môi trường 2D đơn giản và việc thiếu các tương tác phức tạp với các loại tế bào khác và chất nền ngoại bào có thể làm tế bào mất đi một số đặc điểm hình thái và chức năng nguyên bản.
• Yêu cầu kỹ thuật vô trùng nghiêm ngặt: Môi trường nuôi cấy giàu dinh dưỡng cũng là điều kiện lý tưởng cho vi khuẩn, nấm mốc và Mycoplasma phát triển. Nhiễm tạp là một trong những thách thức lớn và phổ biến nhất.
• Bất ổn định di truyền: Trải qua nhiều lần cấy chuyền, các dòng tế bào liên tục có thể tích lũy các biến đổi di truyền (genetic drift), dẫn đến sự thay đổi về kiểu hình và đáp ứng, ảnh hưởng đến tính nhất quán của dữ liệu.
• Chi phí và chuyên môn hóa: Việc thiết lập và duy trì một phòng thí nghiệm nuôi cấy tế bào đòi hỏi đầu tư đáng kể vào trang thiết bị chuyên dụng (tủ cấy an toàn sinh học, tủ ấm CO2) và nhân sự có tay nghề cao.

Tóm lại, Kỹ thuật nuôi cấy tế bào là một công cụ mạnh mẽ và đa năng trong nghiên cứu sinh học và y học, nó cung cấp một hệ thống in vitro để nghiên cứu tế bào trong điều kiện được kiểm soát, mở ra nhiều ứng dụng quan trọng trong nhiều lĩnh vực khác nhau.

Các Kỹ thuật Liên quan và Biến thể

Ngoài các phương pháp nuôi cấy cơ bản, nhiều kỹ thuật chuyên biệt đã được phát triển để đáp ứng các mục tiêu nghiên cứu cụ thể:

• Nuôi cấy huyền phù (Suspension Culture): Áp dụng cho các tế bào không cần bề mặt để phát triển (ví dụ: tế bào máu). Tế bào được nuôi lơ lửng trong môi trường dịch lỏng, thường được khuấy nhẹ để đảm bảo trao đổi khí và dinh dưỡng.
• Nuôi cấy trên vi giá thể (Microcarrier Culture): Một kỹ thuật kết hợp giữa nuôi cấy bám dính và huyền phù. Tế bào bám dính được nuôi trên bề mặt các hạt vi cầu nhỏ (microcarriers) lơ lửng trong môi trường, giúp tăng đáng kể diện tích bề mặt hiệu dụng để sản xuất sinh khối tế bào ở quy mô lớn.
• Nuôi cấy tưới tiêu (Perfusion Culture): Một hệ thống nuôi cấy liên tục trong đó môi trường mới được bổ sung và môi trường cũ (chứa chất thải) được loại bỏ đồng thời. Kỹ thuật này cho phép nuôi cấy tế bào ở mật độ rất cao trong thời gian dài.
• Đồng nuôi cấy (Co-culture): Nuôi cấy hai hoặc nhiều loại tế bào khác nhau trong cùng một môi trường để nghiên cứu các tương tác qua lại giữa chúng, ví dụ như tương tác giữa tế bào ung thư và tế bào miễn dịch.
• Kỹ thuật chuyển gen (Gene Transfer):
  • Biến nạp (Transfection): Đưa vật liệu di truyền (DNA, RNA) ngoại lai vào tế bào bằng các phương pháp không sử dụng virus (ví dụ: hóa chất, xung điện).
  • Tải nạp bằng virus (Viral Transduction): Sử dụng các vector virus đã được biến đổi để vận chuyển gen mong muốn vào tế bào, thường có hiệu suất cao hơn biến nạp.
• Kỹ thuật tạo tế bào lai (Hybridoma Technology): Dung hợp một tế bào B (sản xuất kháng thể) với một tế bào u tủy (myeloma) bất tử để tạo ra một dòng tế bào lai (hybridoma) vừa có khả năng sản xuất một loại kháng thể đặc hiệu duy nhất, vừa có thể phân chia vô hạn. Đây là kỹ thuật nền tảng để sản xuất kháng thể đơn dòng.
• Chỉnh sửa gen bằng CRISPR-Cas9: Sử dụng hệ thống CRISPR-Cas9 để thực hiện các thay đổi chính xác (xóa, thêm, hoặc sửa đổi) tại các vị trí cụ thể trong bộ gen của tế bào, cho phép tạo ra các mô hình tế bào mang đột biến mong muốn để nghiên cứu chức năng gen và bệnh tật.

Các Vấn đề Thường gặp và Cách Khắc phục

• Nhiễm tạp (Contamination):
  • Nguyên nhân: Vi khuẩn, nấm men, nấm mốc, và đặc biệt là *Mycoplasma* (một loại vi khuẩn không có vách tế bào, khó phát hiện bằng kính hiển vi thường).
  • Khắc phục: Tuân thủ nghiêm ngặt kỹ thuật vô trùng trong tủ an toàn sinh học. Sử dụng kháng sinh một cách hợp lý. Thường xuyên kiểm tra sự hiện diện của *Mycoplasma*. Hủy bỏ ngay lập tức các mẫu nuôi cấy bị nhiễm để tránh lây lan.
• Chết tế bào (Cell Death):
  • Nguyên nhân: Điều kiện nuôi cấy không tối ưu (pH, nhiệt độ sai lệch), môi trường cạn kiệt dinh dưỡng hoặc tích tụ độc tố, tổn thương cơ học trong quá trình cấy chuyền, hoặc tế bào sơ cấp đạt đến giới hạn lão hóa.
  • Khắc phục: Tối ưu hóa điều kiện nuôi cấy. Thay môi trường định kỳ. Cấy chuyền tế bào ở mật độ thích hợp và thao tác nhẹ nhàng. Sử dụng tế bào ở số lần cấy chuyền (passage number) thấp.
• Biệt hóa không mong muốn:
  • Nguyên nhân: Thường xảy ra với tế bào gốc do sai sót trong thành phần môi trường, mật độ tế bào không phù hợp, hoặc sự hiện diện của các yếu tố cảm ứng biệt hóa không mong muốn.
  • Khắc phục: Sử dụng các môi trường được định rõ thành phần (defined media) và các yếu tố ức chế biệt hóa. Kiểm soát chặt chẽ mật độ tế bào và kiểm tra định kỳ các dấu ấn (marker) của tính gốc.
• Thay đổi kiểu hình và bất ổn định di truyền:
  • Nguyên nhân: Các dòng tế bào, đặc biệt là dòng tế bào liên tục, có thể thay đổi đặc tính sau nhiều lần cấy chuyền.
  • Khắc phục: Thiết lập một ngân hàng tế bào gốc (master cell bank) và ngân hàng tế bào làm việc (working cell bank) được trữ lạnh từ sớm. Sử dụng tế bào ở số lần cấy chuyền thấp. Định kỳ xác thực lại dòng tế bào (ví dụ: bằng phương pháp STR profiling) và kiểm tra karyotype.

Tóm tắt về Kỹ thuật nuôi cấy tế bào

Kỹ thuật nuôi cấy tế bào là một lĩnh vực rộng lớn và phức tạp, nhưng có một số điểm then chốt cần ghi nhớ. Điều quan trọng nhất là phải duy trì môi trường vô trùng tuyệt đối. Bất kỳ sự nhiễm khuẩn nào, dù là vi khuẩn, nấm hay mycoplasma, đều có thể phá hủy hoàn toàn thí nghiệm. Việc thực hiện các thao tác trong tủ cấy (laminar flow hood) và sử dụng các dụng cụ, môi trường đã được khử trùng là bắt buộc.

Môi trường nuôi cấy phải cung cấp đầy đủ các chất dinh dưỡng cần thiết cho tế bào. Thành phần môi trường có thể khác nhau tùy thuộc vào loại tế bào, nhưng thường bao gồm muối vô cơ (ví dụ, NaCl, KCl), nguồn carbon (thường là glucose – $C6H{12}O_6$), amino acid, vitamin, yếu tố tăng trưởng và huyết thanh. Việc duy trì pH ổn định (thường trong khoảng 7.2 – 7.4) bằng chất đệm (ví dụ, $NaHCO_3$) cũng rất quan trọng. Việc kiểm soát nhiệt độ (thường là 37°C) và nồng độ khí ($CO_2$, thường là 5%) trong tủ ấm là cần thiết cho sự phát triển tối ưu của tế bào.

Cần phân biệt rõ giữa nuôi cấy tế bào sơ cấp và nuôi cấy tế bào dòng. Tế bào sơ cấp được lấy trực tiếp từ mô, có tuổi thọ giới hạn nhưng giữ được nhiều đặc tính in vivo. Tế bào dòng có khả năng phân chia vô hạn, dễ nuôi cấy nhưng có thể mất đi một số đặc tính ban đầu. Việc lựa chọn loại tế bào phù hợp phụ thuộc vào mục đích nghiên cứu. Đối với các ứng dụng cần tế bào có tính chất gần với in vivo nhất, nuôi cấy tế bào 3D đang ngày càng được ưa chuộng vì nó mô phỏng tốt hơn cấu trúc và chức năng của mô.

Cần theo dõi và đánh giá tế bào thường xuyên. Quan sát hình thái tế bào dưới kính hiển vi, đếm tế bào, đo hoạt tính enzyme, phân tích biểu hiện gen/protein là các phương pháp thường dùng. Khi tế bào đạt đến mật độ cao, cần phải cấy chuyền (passaging) để tránh tình trạng tế bào chết do thiếu chất dinh dưỡng và không gian. Việc lưu trữ tế bào bằng cách đông lạnh trong nitơ lỏng (-196°C) với chất bảo vệ đông lạnh (ví dụ, DMSO) là cần thiết để bảo quản tế bào cho các thí nghiệm sau này. Luôn ghi chép đầy đủ và chi tiết mọi thông tin liên quan đến quá trình nuôi cấy, bao gồm nguồn gốc tế bào, thành phần môi trường, số lần cấy chuyền, kết quả kiểm tra.

1. Freshney, R. I. (2010). Culture of animal cells: a manual of basic technique and specialized applications (6th ed.). Wiley-Blackwell. (Đây là cuốn sách kinh điển về nuôi cấy tế bào)
2. Davis, J. M. (2011). Basic cell culture: a practical approach (3rd ed.). Oxford University Press.
3. Masters, J. R. W. (2000). Animal cell culture: a practical approach (3rd ed.). Oxford University Press.
4. Butler, M. (2004). Animal cell culture and technology (2nd ed.). BIOS Scientific Publishers.
5. Các bài báo khoa học trên các tạp chí chuyên ngành như:
   • Nature Methods
   • Cell Culture
   • Biotechnology and Bioengineering
   • Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine
   • Scientific Reports

   Câu hỏi và Giải đáp

   1. Câu hỏi: Các kỹ thuật phân tích tế bào nào thường được sử dụng trong nuôi cấy tế bào để đánh giá tình trạng và chức năng của chúng, và nguyên lý cơ bản của các kỹ thuật đó là gì?Trả lời:
      • Đếm tế bào: Sử dụng buồng đếm (hemocytometer) hoặc máy đếm tế bào tự động. Nguyên lý: Đếm số lượng tế bào trong một thể tích mẫu xác định dưới kính hiển vi (buồng đếm) hoặc dựa trên sự thay đổi trở kháng/tán xạ ánh sáng khi tế bào đi qua một khe hẹp (máy đếm tự động).
      • Đo hoạt tính enzyme: Đo hoạt độ của các enzyme đặc trưng cho tế bào. Ví dụ, đo hoạt độ dehydrogenase (MTT assay, XTT assay) để đánh giá khả năng sống của tế bào. Nguyên lý: Enzyme trong tế bào sống khử các chất phản ứng (MTT, XTT) thành sản phẩm có màu, đo độ hấp thụ ánh sáng của sản phẩm để suy ra hoạt tính enzyme.
      • Phân tích hình thái tế bào: Quan sát hình thái tế bào dưới kính hiển vi quang học hoặc kính hiển vi điện tử. Nguyên lý: Kính hiển vi quang học sử dụng ánh sáng khả kiến, kính hiển vi điện tử sử dụng chùm electron để phóng đại hình ảnh tế bào, cho phép quan sát cấu trúc tế bào ở độ phân giải cao.
      • Kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction): Khuếch đại một đoạn DNA cụ thể. Real-time PCR (qPCR) cho phép định lượng DNA/RNA. Nguyên lý: Sử dụng enzyme DNA polymerase để tổng hợp bản sao của đoạn DNA mục tiêu qua nhiều chu kỳ nhiệt.
      • Western blot: Phát hiện và định lượng protein cụ thể trong mẫu. Nguyên lý: Tách protein bằng điện di trên gel, chuyển protein lên màng, ủ màng với kháng thể đặc hiệu cho protein cần tìm, phát hiện phức hợp kháng nguyên-kháng thể bằng các phương pháp hóa phát quang hoặc huỳnh quang.
      • Flow cytometry: Phân tích các đặc tính của tế bào (kích thước, hình dạng, biểu hiện protein bề mặt) dựa trên sự tán xạ ánh sáng và phát huỳnh quang khi tế bào đi qua dòng chảy. Nguyên lý: Tế bào được đánh dấu bằng các kháng thể huỳnh quang, khi đi qua tia laser, tế bào sẽ phát ra ánh sáng huỳnh quang và tán xạ ánh sáng, các tín hiệu này được thu nhận và phân tích.
      • ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) Phát hiện và định lượng các chất (protein, hormone) trong mẫu dịch. Nguyên lý: Kháng thể hoặc kháng nguyên được gắn lên bề mặt rắn. Sau đó ủ với mẫu và các chất phản ứng, phát hiện bằng phản ứng enzyme tạo màu.
   2. Câu hỏi: Mycoplasma là gì và tại sao việc kiểm tra nhiễm mycoplasma lại quan trọng trong nuôi cấy tế bào? Các phương pháp nào được sử dụng để phát hiện mycoplasma?Trả lời: Mycoplasma là một loại vi khuẩn rất nhỏ, không có vách tế bào, thường gây nhiễm trong nuôi cấy tế bào. Chúng rất khó phát hiện bằng kính hiển vi thông thường và không bị tiêu diệt bởi các kháng sinh thông thường. Nhiễm mycoplasma có thể ảnh hưởng đến nhiều khía cạnh của tế bào: thay đổi quá trình trao đổi chất, biểu hiện gen, hình thái, khả năng tăng trưởng và thậm chí gây chết tế bào. Do đó, việc kiểm tra nhiễm mycoplasma định kỳ là rất quan trọng để đảm bảo chất lượng và độ tin cậy của các thí nghiệm.

      Các phương pháp phát hiện mycoplasma:

      • Nuôi cấy mycoplasma: Cấy mẫu trên môi trường đặc biệt cho mycoplasma, sau đó quan sát sự hình thành khuẩn lạc. Phương pháp này có độ nhạy cao nhưng mất nhiều thời gian.
      • Kỹ thuật PCR: Phát hiện DNA của mycoplasma. Phương pháp này nhanh và nhạy.
      • Nhuộm màu DNA (ví dụ: Hoechst 33258): Mycoplasma có DNA, khi nhuộm bằng các chất nhuộm DNA, có thể quan sát thấy các đốm nhỏ trong bào tương của tế bào nhiễm (ngoài nhân).
      • Kỹ thuật ELISA: Phát hiện kháng nguyên của mycoplasma.
      • Đo hoạt tính enzyme của Mycoplasma. Một số loại mycoplasma có các enzyme đặc trưng, có thể đo hoạt tính của các enzyme đó để phát hiện.
   3. Câu hỏi: Các yếu tố tăng trưởng (growth factors) nào thường được sử dụng trong nuôi cấy tế bào và vai trò của chúng là gì?Trả lời: Yếu tố tăng trưởng là các protein tự nhiên, kích thích sự tăng trưởng, phân chia và biệt hóa tế bào. Chúng hoạt động bằng cách liên kết với các thụ thể (receptors) đặc hiệu trên bề mặt tế bào, khởi động các con đường tín hiệu nội bào.
      • EGF (Epidermal Growth Factor): Kích thích sự tăng trưởng và phân chia của các tế bào biểu bì và nhiều loại tế bào khác.
      • FGF (Fibroblast Growth Factor): Kích thích sự tăng trưởng và phân chia của các nguyên bào sợi (fibroblasts) và nhiều loại tế bào khác.
      • PDGF (Platelet-Derived Growth Factor): Kích thích sự tăng trưởng và phân chia của các tế bào trung mô (mesenchymal cells), bao gồm nguyên bào sợi, tế bào cơ trơn.
      • VEGF (Vascular Endothelial Growth Factor): Kích thích sự hình thành mạch máu (angiogenesis).
      • TGF-β (Transforming Growth Factor-beta): Có nhiều vai trò, bao gồm kích thích sự tăng trưởng, biệt hóa và ức chế sự tăng trưởng (tùy thuộc vào loại tế bào và nồng độ).
      • IGF-1 (Insulin-like Growth Factor-1): Kích thích sự tăng trưởng và phát triển của nhiều loại tế bào.
      • HGF (Hepatocyte Growth Factor): Kích thích sự tăng trưởng và phân chia của tế bào gan và một số loại tế bào khác.
      • Neurotrophins (ví dụ: NGF – Nerve Growth Factor, BDNF – Brain-Derived Neurotrophic Factor): Kích thích sự sống, phát triển và biệt hóa của tế bào thần kinh.
   4. Câu hỏi: Huyết thanh (serum) thường được sử dụng trong nuôi cấy tế bào có vai trò gì và tại sao việc sử dụng huyết thanh lại gây ra một số lo ngại? Có những giải pháp thay thế huyết thanh nào?Trả lời: Huyết thanh (thường là huyết thanh bê bào thai – FBS) cung cấp một hỗn hợp phức tạp các chất dinh dưỡng, yếu tố tăng trưởng, hormone, protein bám dính và các chất khác cần thiết cho sự sống và phát triển của tế bào. Tuy nhiên, việc sử dụng huyết thanh có một số hạn chế và lo ngại:
      • Thành phần không xác định và biến đổi: Thành phần của huyết thanh có thể thay đổi giữa các lô sản xuất, ảnh hưởng đến tính ổn định và khả năng tái lặp của thí nghiệm.
      • Nguy cơ nhiễm các tác nhân ngoại lai: Huyết thanh có thể chứa virus, mycoplasma, endotoxin.
      • Vấn đề đạo đức: Việc thu hoạch huyết thanh bê bào thai liên quan đến việc giết mổ bò mang thai.

      Các giải pháp thay thế huyết thanh:

      • Môi trường không chứa huyết thanh (serum-free medium): Môi trường được bổ sung các thành phần xác định (yếu tố tăng trưởng, hormone, protein…) thay cho huyết thanh.
      • Môi trường giảm huyết thanh (reduced-serum medium): Môi trường chứa một lượng nhỏ huyết thanh (thường dưới 2%) kết hợp với các chất bổ sung.
      • Môi trường xác định hóa học (chemically defined medium): Môi trường chỉ chứa các thành phần hóa học đã biết, không chứa bất kỳ thành phần nào có nguồn gốc động vật.
      • Chất thay thế huyết thanh (serum replacement): Các sản phẩm thương mại chứa hỗn hợp các chất dinh dưỡng và yếu tố tăng trưởng, được thiết kế để thay thế huyết thanh.
   5. Câu hỏi: Giải thích nguyên tắc của kỹ thuật CRISPR-Cas9 và ứng dụng của nó trong nuôi cấy tế bào?Trả lời:
      CRISPR-Cas9 (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats – CRISPR associated protein 9) là một hệ thống chỉnh sửa gen cho phép cắt DNA tại vị trí xác định.
      • Nguyên tắc: Hệ thống CRISPR-Cas9 bao gồm hai thành phần chính:
        • Enzyme Cas9: Hoạt động như một “kéo” cắt DNA.
        • RNA hướng dẫn (guide RNA – gRNA): Một đoạn RNA ngắn có trình tự bổ sung với trình tự DNA mục tiêu. gRNA dẫn Cas9 đến vị trí cần cắt trên DNA.
          Khi phức hợp Cas9-gRNA liên kết với DNA mục tiêu, Cas9 sẽ cắt DNA tại vị trí đó, tạo ra đứt gãy sợi đôi (double-strand break – DSB). Tế bào sẽ tự sửa chữa DSB bằng hai cơ chế:
        • NHEJ (Non-Homologous End Joining): Cơ chế sửa chữa không chính xác, thường dẫn đến đột biến mất hoặc thêm nucleotide (indel), gây mất chức năng gen.
        • HDR (Homology-Directed Repair): Cơ chế sửa chữa chính xác, sử dụng một khuôn mẫu DNA (template) để sửa chữa DSB. Nếu cung cấp một khuôn mẫu DNA ngoại lai, có thể chèn một đoạn gen mới vào vị trí cắt.
      • Ứng dụng trong nuôi cấy tế bào:
        • Tạo dòng tế bào đột biến (knockout/knockin): Bất hoạt một gen (knockout) hoặc chèn một gen mới (knockin) vào tế bào.
        • Sửa chữa gen đột biến: Sửa chữa các gen gây bệnh trong tế bào.
        • Nghiên cứu chức năng gen: Tìm hiểu vai trò của gen bằng cách bất hoạt hoặc thay đổi biểu hiện của gen đó.
        • Tạo mô hình bệnh trên tế bào: Tạo các dòng tế bào mang đột biến gây bệnh để nghiên cứu cơ chế bệnh sinh và thử nghiệm thuốc.
        • Sàng lọc gen (genetic screening): Tạo một thư viện các tế bào, mỗi tế bào bị bất hoạt 1 gen, từ đó xác định được gen nào có liên quan đến 1 quá trình/tính trạng cụ thể.
   Một số điều thú vị về Kỹ thuật nuôi cấy tế bào

   • Tế bào HeLa: Dòng tế bào HeLa, có nguồn gốc từ tế bào ung thư cổ tử cung của Henrietta Lacks vào năm 1951, là dòng tế bào người đầu tiên được nuôi cấy thành công và được sử dụng rộng rãi trong nghiên cứu y sinh. Điều thú vị là tế bào HeLa có khả năng phân chia vô hạn và đã đóng góp vào nhiều khám phá khoa học quan trọng, bao gồm phát triển vắc-xin bại liệt. Tuy nhiên, việc sử dụng tế bào HeLa cũng gây ra nhiều tranh cãi về đạo đức vì chúng được lấy mà không có sự đồng ý của Henrietta Lacks hay gia đình bà.
   • Nuôi cấy tế bào trong không gian: Các nhà khoa học đã thực hiện các thí nghiệm nuôi cấy tế bào trong môi trường không trọng lực (trên các trạm vũ trụ) để nghiên cứu ảnh hưởng của vi trọng lực lên sự phát triển và chức năng của tế bào. Kết quả cho thấy có những thay đổi đáng kể trong hình thái, biểu hiện gen và quá trình trao đổi chất của tế bào.
   • “Thịt” nhân tạo: Kỹ thuật nuôi cấy tế bào đang được ứng dụng để sản xuất “thịt” nhân tạo (cultured meat) trong phòng thí nghiệm. Các tế bào cơ của động vật (bò, gà, lợn…) được nuôi cấy và biệt hóa thành mô cơ, tạo ra sản phẩm tương tự như thịt truyền thống. Đây là một hướng đi tiềm năng để giải quyết vấn đề an ninh lương thực và giảm tác động của ngành chăn nuôi đến môi trường.
   • Mini-organs (Organoids): Kỹ thuật nuôi cấy tế bào 3D đã cho phép tạo ra các “mini-organs” (organoids) – các cấu trúc ba chiều nhỏ mô phỏng cấu trúc và chức năng của các cơ quan trong cơ thể (ví dụ: não, gan, ruột, thận). Organoids là công cụ hữu ích để nghiên cứu sự phát triển của cơ quan, bệnh lý và thử nghiệm thuốc.
   • Tế bào bất tử do virus: Một số dòng tế bào được “bất tử hóa” (immortalized) bằng cách sử dụng virus. Ví dụ, virus Epstein-Barr (EBV) có thể biến đổi tế bào lympho B thành dòng tế bào lymphoblastoid có khả năng phân chia liên tục.
   • Tế bào có thể “nhớ”: Các nghiên cứu gần đây cho thấy tế bào nuôi cấy có thể “nhớ” các kích thích trước đó và phản ứng khác nhau trong những lần tiếp xúc sau. Điều này cho thấy tế bào có khả năng học hỏi và thích nghi ở một mức độ nào đó.