Nhuộm Giemsa (Giemsa staining)

Nguyên lý

Nhuộm Giemsa hoạt động dựa trên sự liên kết khác nhau của các thuốc nhuộm với các thành phần tế bào. Cơ chế nhuộm dựa trên sự tương tác giữa thuốc nhuộm và các thành phần tế bào mang điện tích.

• Xanh methylene và Azure B: là các thuốc nhuộm bazơ, mang điện tích dương và liên kết với các cấu trúc mang điện tích âm như DNA và RNA trong nhân tế bào, ribosome và các hạt bazophilic trong tế bào chất. Sự liên kết này dẫn đến màu sắc từ xanh dương đến tím.
• Eosin: là một thuốc nhuộm acid, mang điện tích âm và liên kết với các cấu trúc mang điện tích dương như hemoglobin trong hồng cầu và các hạt eosinophilic trong tế bào chất. Sự liên kết này dẫn đến màu hồng hoặc đỏ.

Sự kết hợp của cả ba thuốc nhuộm cho phép phân biệt chi tiết các cấu trúc tế bào dựa trên tính acid hoặc bazơ của chúng. Ví dụ, nhân tế bào giàu DNA/RNA sẽ bắt màu xanh dương đậm đến tím do ái tính với xanh methylene và Azure B. Trong khi đó, tế bào chất của một số tế bào sẽ bắt màu hồng do ái tính với eosin. Chính sự tương tác đặc hiệu này tạo nên giá trị của phương pháp nhuộm Giemsa trong việc phân biệt các loại tế bào và phát hiện các bất thường về hình thái tế bào.

Quy trình nhuộm Giemsa (tóm tắt)

Quy trình cụ thể có thể thay đổi tùy thuộc vào loại mẫu và mục đích nhuộm, nhưng thường bao gồm các bước sau:

1. Cố định: Cố định mẫu trên phiến kính bằng methanol hoặc dung dịch cố định khác để bảo tồn cấu trúc tế bào. Thời gian cố định cũng cần được tối ưu hóa tùy thuộc vào loại mẫu.
2. Nhuộm: Ngâm phiến kính trong dung dịch Giemsa pha loãng (thường theo tỷ lệ 1:10 hoặc 1:20 với dung dịch đệm) trong một khoảng thời gian nhất định (khoảng 15-30 phút). Nồng độ và thời gian nhuộm có thể được điều chỉnh để đạt được kết quả tối ưu.
3. Rửa: Rửa phiến kính bằng nước cất hoặc dung dịch đệm (đệm phosphate pH 6.8-7.2 thường được sử dụng) để loại bỏ thuốc nhuộm dư thừa. Việc rửa nhẹ nhàng giúp tránh làm bong tróc mẫu.
4. Sấy khô: Sấy khô phiến kính trong không khí hoặc bằng giấy thấm. Tránh lau mạnh để không làm hỏng mẫu.
5. Quan sát: Quan sát phiến kính dưới kính hiển vi quang học, thường sử dụng vật kính 100x kết hợp với dầu soi.

Ứng dụng

Nhuộm Giemsa có nhiều ứng dụng trong các lĩnh vực khác nhau:

• Huyết học: Phân biệt các loại bạch cầu (neutrophil, eosinophil, basophil, lymphocyte, monocyte), xác định ký sinh trùng máu ( Plasmodium gây bệnh sốt rét, Trypanosoma, Leishmania), chẩn đoán các bệnh lý về máu như bệnh bạch cầu.
• Tế bào học: Nghiên cứu hình thái tế bào, phát hiện các bất thường về nhiễm sắc thể.
• Mô bệnh học: Xác định vi khuẩn Helicobacter pylori trong sinh thiết dạ dày.
• Di truyền học: Phân tích nhiễm sắc thể, xác định băng nhiễm sắc thể (chromosome banding) để nghiên cứu cấu trúc nhiễm sắc thể và phát hiện các bất thường di truyền.

Ưu điểm

• Quy trình đơn giản, dễ thực hiện, không yêu cầu thiết bị phức tạp.
• Giá thành rẻ, dễ tiếp cận.
• Cho kết quả nhuộm rõ ràng, dễ phân biệt các cấu trúc tế bào.

Nhược điểm

• Có thể bị ảnh hưởng bởi chất lượng thuốc nhuộm và kỹ thuật nhuộm. Sự khác biệt về nồng độ, độ pH, và thời gian nhuộm có thể dẫn đến kết quả không chính xác.
• Kết quả nhuộm có thể khác nhau tùy thuộc vào loại mẫu và thời gian nhuộm. Việc tối ưu hóa quy trình cho từng loại mẫu là rất quan trọng.

Lưu ý

Dung dịch Giemsa thường được pha loãng từ dung dịch gốc đậm đặc trước khi sử dụng. Tỷ lệ pha loãng và thời gian nhuộm tối ưu cần được xác định dựa trên từng loại mẫu và mục đích nhuộm. Nên sử dụng dung dịch đệm phosphate (pH 6.8-7.2) để pha loãng thuốc nhuộm Giemsa và rửa phiến kính.

Thành phần của dung dịch Giemsa

Dung dịch Giemsa là một hỗn hợp phức tạp của các thuốc nhuộm, chủ yếu bao gồm:

• Xanh methylene (Methylene blue): Một thuốc nhuộm bazơ, có công thức hóa học là C₁₆H₁₈ClN₃S.
• Azure B (Azure B): Sản phẩm oxy hóa của xanh methylene. Azure B góp phần tạo nên màu sắc tím đặc trưng của nhuộm Giemsa.
• Eosin Y (Eosin Y): Một thuốc nhuộm acid, có công thức hóa học là C₂₀H₈Br₄O₅.
• Glycerol: Dùng làm dung môi và chất ổn định cho thuốc nhuộm.
• Methanol: Dùng làm dung môi và chất cố định.

Các biến thể của nhuộm Giemsa

Có một số biến thể của kỹ thuật nhuộm Giemsa, bao gồm:

• Nhuộm Giemsa-Wright: Kết hợp Giemsa với thuốc nhuộm Wright, thường được sử dụng trong huyết học để phân biệt các loại tế bào máu.
• Nhuộm Giemsa-May-Grünwald: Kết hợp Giemsa với thuốc nhuộm May-Grünwald, cung cấp độ tương phản tốt hơn cho các cấu trúc tế bào. Phương pháp này thường được sử dụng để nhuộm tế bào máu và tủy xương.

Phân tích kết quả nhuộm Giemsa

Việc phân tích kết quả nhuộm Giemsa đòi hỏi kiến thức chuyên môn và kinh nghiệm. Màu sắc và hình thái của các cấu trúc tế bào được quan sát dưới kính hiển vi quang học sẽ cung cấp thông tin về loại tế bào, tình trạng nhiễm trùng và các bất thường khác. Ví dụ:

• Nhân tế bào: Nhuộm màu xanh tím đậm.
• Tế bào chất: Có thể nhuộm màu hồng, xanh nhạt hoặc tím tùy thuộc vào loại tế bào.
• Ký sinh trùng sốt rét: Xuất hiện dưới dạng các cấu trúc màu tím trong hồng cầu.

Giới hạn của nhuộm Giemsa

Mặc dù nhuộm Giemsa là một kỹ thuật hữu ích, nhưng nó cũng có một số giới hạn:

• Độ phân giải: Kỹ thuật này có độ phân giải hạn chế so với các kỹ thuật nhuộm tiên tiến hơn như nhuộm miễn dịch huỳnh quang.
• Sự chủ quan: Việc phân tích kết quả nhuộm Giemsa có thể bị ảnh hưởng bởi sự chủ quan của người quan sát. Cần có kinh nghiệm và tiêu chuẩn đánh giá rõ ràng.
• Yêu cầu kỹ thuật: Kỹ thuật nhuộm cần được thực hiện cẩn thận và đúng quy trình để đảm bảo kết quả chính xác. Sự sai sót trong quá trình cố định, nhuộm, hay rửa có thể ảnh hưởng đến kết quả.

• Bancroft, J. D., & Gamble, M. (Eds.). (2008). Theory and practice of histological techniques. Churchill Livingstone.
• WHO. (2010). Basic malaria microscopy. World Health Organization.
• Sheehan, D. C., & Hrapchak, B. B. (1980). Theory and practice of histotechnology. The C.V. Mosby Company.

Câu hỏi và Giải đáp

Tại sao methanol lại được sử dụng trong quy trình nhuộm Giemsa?

Trả lời: Methanol đóng vai trò quan trọng trong hai bước của quy trình nhuộm Giemsa. Thứ nhất, nó hoạt động như một chất cố định, giúp bảo tồn hình thái tế bào bằng cách làm đông protein và ngăn chặn sự phân hủy tế bào. Thứ hai, methanol giúp làm cho màng tế bào thấm hơn với thuốc nhuộm, cho phép thuốc nhuộm xâm nhập vào tế bào và liên kết với các cấu trúc bên trong.

Sự khác biệt chính giữa nhuộm Giemsa và nhuộm Wright-Giemsa là gì?

Trả lời: Cả hai kỹ thuật đều sử dụng hỗn hợp thuốc nhuộm, nhưng có sự khác biệt về thành phần và ứng dụng. Nhuộm Giemsa chủ yếu sử dụng xanh methylene, Azure B và Eosin Y, trong khi Wright-Giemsa kết hợp dung dịch Giemsa với thuốc nhuộm Wright, chứa cả xanh methylene và eosin. Wright-Giemsa thường được sử dụng trong huyết học để phân biệt các loại tế bào máu, trong khi nhuộm Giemsa có ứng dụng rộng rãi hơn, bao gồm cả việc xác định ký sinh trùng và phân tích nhiễm sắc thể.

Làm thế nào để phân biệt ký sinh trùng sốt rét ( Plasmodium) trong mẫu máu nhuộm Giemsa?

Trả lời: Ký sinh trùng Plasmodium xuất hiện dưới dạng các cấu trúc màu xanh tím hoặc tím đậm bên trong hồng cầu khi nhuộm Giemsa. Hình dạng và vị trí của ký sinh trùng trong hồng cầu sẽ khác nhau tùy thuộc vào giai đoạn phát triển của nó. Ví dụ, thể trophozoite thường có hình dạng vòng nhẫn, trong khi thể schizont chứa nhiều hạt nhân.

Ảnh hưởng của pH đến kết quả nhuộm Giemsa như thế nào?

Trả lời: pH của dung dịch nhuộm Giemsa ảnh hưởng đáng kể đến kết quả nhuộm. Dung dịch đệm phosphate với pH khoảng 6.8 hoặc 7.2 thường được sử dụng để đảm bảo sự liên kết tối ưu của thuốc nhuộm với các thành phần tế bào. pH quá cao hoặc quá thấp có thể làm thay đổi ái lực của thuốc nhuộm, dẫn đến kết quả nhuộm không chính xác.

Ngoài máu, nhuộm Giemsa còn có thể được áp dụng cho những loại mẫu nào khác?

Trả lời: Nhuộm Giemsa có thể được áp dụng cho nhiều loại mẫu sinh học khác nhau, bao gồm tủy xương, dịch não tủy, mẫu sinh thiết mô (ví dụ như dạ dày để phát hiện H. pylori), và các mẫu tế bào nuôi cấy. Tùy thuộc vào loại mẫu, quy trình nhuộm có thể cần điều chỉnh về thời gian nhuộm và nồng độ dung dịch.