Nhuộm Gram (Gram staining)

Nhuộm Gram là một kỹ thuật nhuộm vi khuẩn được sử dụng rộng rãi trong vi sinh vật học để phân biệt vi khuẩn thành hai nhóm lớn, dựa trên sự khác biệt về thành tế bào của chúng: Gram dương và Gram âm. Kỹ thuật này được phát triển bởi nhà khoa học người Đan Mạch Hans Christian Gram vào năm 1884.

Nguyên lý

Sự khác biệt trong phản ứng nhuộm Gram liên quan đến cấu trúc thành tế bào của vi khuẩn. Thành tế bào của vi khuẩn Gram dương dày và chứa một lớp peptidoglycan dày, trong khi vi khuẩn Gram âm có lớp peptidoglycan mỏng nằm giữa màng trong và màng ngoài. Chính sự khác biệt này quyết định khả năng giữ màu của vi khuẩn sau khi nhuộm và rửa bằng cồn.

Vi khuẩn Gram dương: Có lớp peptidoglycan dày và không có màng ngoài. Lớp peptidoglycan này giữ lại phức hợp crystal violet-iodine (CV-I) sau khi rửa bằng cồn, khiến vi khuẩn có màu tím. Cồn làm co lớp peptidoglycan dày, bịt kín phức hợp CV-I bên trong tế bào.
Vi khuẩn Gram âm: Có lớp peptidoglycan mỏng nằm giữa màng trong và màng ngoài. Màng ngoài giàu lipopolysaccharide bị phá vỡ bởi cồn, làm mất phức hợp CV-I. Sau đó, vi khuẩn được nhuộm màu hồng bởi thuốc nhuộm đối lập (safranin hoặc fuchsin). Lớp peptidoglycan mỏng không thể giữ lại phức hợp CV-I sau khi màng ngoài bị phá vỡ.

Quy trình nhuộm Gram

Quy trình nhuộm Gram bao gồm bốn bước chính:

Nhuộm chính (Crystal violet): Mẫu được nhuộm với crystal violet, một loại thuốc nhuộm màu tím. Cả vi khuẩn Gram dương và Gram âm đều hấp thụ crystal violet và có màu tím.
Nhuộm cố định (Lugol’s iodine): Lugol’s iodine (dung dịch I₂ và KI) được thêm vào để tạo thành phức hợp crystal violet-iodine (CV-I) lớn hơn trong tế bào vi khuẩn. Phức hợp này ít tan trong nước, giúp giữ màu tím trong tế bào. Bước này giúp cố định màu tím crystal violet vào thành tế bào.
Rửa bằng cồn (Ethanol hoặc Acetone): Đây là bước quan trọng nhất trong quy trình. Cồn hoạt động như một chất tẩy màu. Ở vi khuẩn Gram dương, cồn làm co lớp peptidoglycan dày, giữ chặt phức hợp CV-I, vi khuẩn vẫn giữ màu tím. Ở vi khuẩn Gram âm, cồn hòa tan màng ngoài và làm tăng độ thấm của lớp peptidoglycan mỏng, cho phép phức hợp CV-I thoát ra khỏi tế bào. Thời gian rửa bằng cồn rất quan trọng và cần được kiểm soát chính xác.
Nhuộm đối lập (Safranin hoặc Fuchsin): Thuốc nhuộm đối lập, thường là safranin (màu hồng) hoặc fuchsin (màu đỏ), được sử dụng để nhuộm các tế bào vi khuẩn Gram âm đã bị mất màu trong bước rửa bằng cồn. Vi khuẩn Gram dương vẫn giữ màu tím đậm từ crystal violet, trong khi vi khuẩn Gram âm có màu hồng hoặc đỏ.

Kết quả

Gram dương: Màu tím
Gram âm: Màu hồng hoặc đỏ

Ứng dụng

Nhuộm Gram là một công cụ chẩn đoán quan trọng trong vi sinh vật học. Nó được sử dụng để:

Phân loại vi khuẩn: Xác định loại vi khuẩn (Gram dương hoặc Gram âm).
Chẩn đoán nhiễm trùng: Giúp xác định nguyên nhân gây nhiễm trùng và lựa chọn kháng sinh phù hợp. Kết quả nhuộm Gram cho phép bác sĩ nhanh chóng đưa ra quyết định điều trị ban đầu trong khi chờ kết quả nuôi cấy.
Nghiên cứu vi sinh vật: Nghiên cứu cấu trúc và đặc tính của vi khuẩn.

Lưu ý

Tuổi của vi khuẩn có thể ảnh hưởng đến kết quả nhuộm Gram. Vi khuẩn Gram dương già có thể xuất hiện Gram âm do sự thoái hóa của thành tế bào.
Một số vi khuẩn không phản ứng với nhuộm Gram, ví dụ như Mycobacteria (do có lớp sáp acid mycolic bên ngoài), Mycoplasma (không có thành tế bào peptidoglycan), Treponema pallidum (quá mỏng để quan sát bằng kính hiển vi quang học thông thường).

Nhuộm Gram là một kỹ thuật cơ bản nhưng rất quan trọng trong vi sinh vật học, giúp cung cấp thông tin nhanh chóng và hữu ích về các loại vi khuẩn khác nhau.

Các yếu tố ảnh hưởng đến kết quả nhuộm Gram

Kết quả nhuộm Gram có thể bị ảnh hưởng bởi một số yếu tố, bao gồm:

Tuổi của nuôi cấy: Nuôi cấy vi khuẩn cũ có thể mất khả năng giữ lại phức hợp crystal violet-iodine, dẫn đến kết quả Gram biến đổi (Gram dương có thể nhuộm Gram âm).
Kỹ thuật nhuộm: Thời gian nhuộm, rửa và tẩy màu không đúng cách có thể ảnh hưởng đến kết quả. Rửa quá kỹ bằng cồn có thể làm mất màu cả vi khuẩn Gram dương. Việc chuẩn bị mẫu phù hợp cũng rất quan trọng, lớp mẫu quá dày có thể gây khó khăn cho việc quan sát và phân tích.
Loại vi khuẩn: Một số vi khuẩn vốn đã khó nhuộm Gram hoặc cho kết quả không rõ ràng. Ví dụ, Mycobacteria có lớp thành tế bào giàu lipid, cản trở việc xâm nhập của thuốc nhuộm, cần phương pháp nhuộm đặc biệt khác (nhuộm Ziehl-Neelsen). Một số vi khuẩn khác như Mycoplasma không có thành tế bào peptidoglycan nên không thể nhuộm Gram.

Các biến thể của kỹ thuật nhuộm Gram

Có một số biến thể của kỹ thuật nhuộm Gram, được phát triển để tối ưu hóa việc nhuộm cho các loại mẫu cụ thể. Ví dụ:

Nhuộm Kopeloff: Một biến thể sử dụng safranin làm thuốc nhuộm đối lập và thêm bước nhuộm bằng dung dịch CuSO₄ để tăng cường độ tương phản.

So sánh Nhuộm Gram với các kỹ thuật nhuộm khác

Nhuộm Gram thường được sử dụng kết hợp với các kỹ thuật nhuộm khác để cung cấp thông tin đầy đủ hơn về vi khuẩn. Ví dụ:

Nhuộm Ziehl-Neelsen: Được sử dụng để phát hiện vi khuẩn kháng acid, chẳng hạn như Mycobacteria.
Nhuộm bào tử: Được sử dụng để phát hiện bào tử vi khuẩn.
Nhuộm vỏ: Được sử dụng để phát hiện vỏ bọc polysaccharide xung quanh một số vi khuẩn.

Giới hạn của Nhuộm Gram

Mặc dù nhuộm Gram là một kỹ thuật hữu ích, nó cũng có một số giới hạn:

Không phải tất cả vi khuẩn đều có thể nhuộm Gram.
Kết quả có thể bị ảnh hưởng bởi các yếu tố kỹ thuật.
Nhuộm Gram chỉ cung cấp thông tin về cấu trúc thành tế bào, không cung cấp thông tin chi tiết về đặc điểm sinh hóa hoặc di truyền của vi khuẩn. Để xác định chính xác loài vi khuẩn, cần thực hiện các xét nghiệm bổ sung như nuôi cấy và xét nghiệm sinh hóa.

Tóm tắt về Nhuộm Gram

Nhuộm Gram là một kỹ thuật nhuộm phân biệt vi khuẩn dựa trên sự khác biệt về thành tế bào, phân loại chúng thành Gram dương (màu tím) và Gram âm (màu hồng/đỏ). Sự khác biệt về màu sắc này là do cấu trúc thành tế bào: vi khuẩn Gram dương có lớp peptidoglycan dày giữ lại phức hợp crystal violet-iodine (CV-I), trong khi vi khuẩn Gram âm có lớp peptidoglycan mỏng và màng ngoài, dễ bị mất màu bởi cồn và sau đó được nhuộm bởi thuốc nhuộm đối lập.

Quy trình nhuộm Gram gồm 4 bước chính: nhuộm crystal violet, nhuộm cố định bằng lugol iodine ($I_2$ và KI), tẩy màu bằng cồn, và nhuộm đối lập bằng safranin/fuchsin. Bước tẩy màu bằng cồn là bước quan trọng nhất, quyết định kết quả nhuộm Gram.

Kết quả nhuộm Gram cung cấp thông tin quan trọng cho việc chẩn đoán nhiễm trùng và lựa chọn kháng sinh phù hợp. Tuy nhiên, cần lưu ý rằng tuổi của nuôi cấy, kỹ thuật nhuộm, và đặc điểm của một số loại vi khuẩn có thể ảnh hưởng đến kết quả. Một số vi khuẩn không thể nhuộm Gram hoặc cho kết quả không rõ ràng.

Nhuộm Gram thường được sử dụng kết hợp với các kỹ thuật nhuộm khác như nhuộm Ziehl-Neelsen, nhuộm bào tử, và nhuộm vỏ để có cái nhìn toàn diện hơn về vi khuẩn. Mặc dù là một kỹ thuật cơ bản và mạnh mẽ, nhuộm Gram chỉ cung cấp thông tin về cấu trúc thành tế bào, không cung cấp thông tin chi tiết về các đặc điểm khác của vi khuẩn. Vì vậy, cần kết hợp với các phương pháp khác để xác định chính xác vi khuẩn.

Tài liệu tham khảo:

Beveridge, T. J. (1999). Structures of gram-negative cell walls and their derived membrane vesicles. Journal of bacteriology, 181(16), 4725–4733.
Madigan, M. T., Martinko, J. M., Bender, K. S., Buckley, D. H., & Stahl, D. A. (2015). Brock biology of microorganisms. Pearson.
Prescott, L. M., Harley, J. P., & Klein, D. A. (2002). Microbiology. McGraw-Hill.

Câu hỏi và Giải đáp

Tại sao cồn lại là bước quan trọng nhất trong quy trình nhuộm Gram?

Trả lời: Cồn là bước quan trọng nhất vì nó quyết định vi khuẩn sẽ giữ lại hay mất màu của crystal violet. Ở vi khuẩn Gram dương, cồn làm mất nước và co rút lớp peptidoglycan dày, khiến phức hợp CV-I bị giữ lại bên trong tế bào, dẫn đến màu tím. Ở vi khuẩn Gram âm, cồn hòa tan màng ngoài và làm tăng độ thẩm thấu của lớp peptidoglycan mỏng, cho phép phức hợp CV-I thoát ra, dẫn đến việc vi khuẩn bị mất màu và sau đó được nhuộm hồng bởi safranin.

Ngoài peptidoglycan, còn yếu tố nào khác ảnh hưởng đến kết quả nhuộm Gram?

Trả lời: Ngoài peptidoglycan, các yếu tố khác cũng có thể ảnh hưởng đến kết quả nhuộm Gram bao gồm: tuổi của nuôi cấy (nuôi cấy cũ có thể cho kết quả Gram biến đổi), kỹ thuật nhuộm (thời gian nhuộm và rửa không đúng cách), và thành phần axit teichoic ở vi khuẩn Gram dương (giúp giữ màu tím). Ngoài ra, một số vi khuẩn có thành tế bào đặc biệt, ví dụ như Mycobacteria có lớp lipid dày, không thể nhuộm Gram bằng phương pháp thông thường.

Nếu quên bước nhuộm đối lập bằng safranin, kết quả sẽ ra sao?

Trả lời: Nếu quên bước nhuộm safranin, vi khuẩn Gram âm sẽ không có màu, tức là không thể quan sát được dưới kính hiển vi ánh sáng thường. Vi khuẩn Gram dương vẫn giữ màu tím của crystal violet. Vì vậy, bạn sẽ chỉ nhìn thấy vi khuẩn Gram dương và không thể phân biệt được sự hiện diện của vi khuẩn Gram âm.

Có thể sử dụng các thuốc nhuộm khác thay thế cho crystal violet và safranin trong nhuộm Gram không?

Trả lời: Có thể sử dụng một số thuốc nhuộm khác, nhưng crystal violet và safranin là cặp thuốc nhuộm được sử dụng phổ biến nhất và cho kết quả rõ ràng nhất. Một số biến thể của nhuộm Gram có thể sử dụng các thuốc nhuộm khác như methylene blue thay cho crystal violet hoặc fuchsin thay cho safranin. Tuy nhiên, việc thay đổi thuốc nhuộm có thể ảnh hưởng đến kết quả và cần phải được kiểm chứng cẩn thận.

Nhuộm Gram có ý nghĩa gì trong việc lựa chọn kháng sinh?

Trả lời: Kết quả nhuộm Gram cung cấp thông tin quan trọng giúp bác sĩ lựa chọn kháng sinh phù hợp. Một số kháng sinh, như penicillin, hoạt động hiệu quả trên vi khuẩn Gram dương do ức chế tổng hợp peptidoglycan. Trong khi đó, một số kháng sinh khác lại hiệu quả hơn trên vi khuẩn Gram âm. Vì vậy, việc biết được vi khuẩn gây nhiễm trùng là Gram dương hay Gram âm sẽ giúp bác sĩ đưa ra quyết định điều trị nhanh chóng và hiệu quả hơn, đặc biệt trong các trường hợp nhiễm trùng cấp tính.

Một số điều thú vị về Nhuộm Gram

Nguồn gốc bất ngờ: Mặc dù được đặt tên theo Hans Christian Gram, ông thực sự không có ý định tạo ra một phương pháp phân loại vi khuẩn. Mục tiêu ban đầu của ông là phát triển một kỹ thuật để phân biệt vi khuẩn phế cầu khuẩn với các tế bào mô phổi trong các mẫu mô bệnh học. Ông đã “tình cờ” phát hiện ra sự khác biệt về nhuộm màu giữa các loại vi khuẩn.
Không phải lúc nào cũng đáng tin cậy: Kết quả nhuộm Gram không phải lúc nào cũng tuyệt đối. Một số vi khuẩn Gram dương có thể cho kết quả Gram âm nếu nuôi cấy quá già hoặc kỹ thuật nhuộm không chính xác. Điều này nhấn mạnh tầm quan trọng của việc thực hiện đúng quy trình và diễn giải kết quả cẩn thận.
Không chỉ dành cho vi khuẩn: Mặc dù được sử dụng chủ yếu cho vi khuẩn, kỹ thuật nhuộm Gram cũng có thể được áp dụng cho nấm, đặc biệt là nấm men. Tuy nhiên, kết quả nhuộm Gram cho nấm không mang ý nghĩa phân loại quan trọng như đối với vi khuẩn.
Màu sắc không phải lúc nào cũng tím và hồng: Mặc dù thường được mô tả là tím và hồng, màu sắc thực tế của vi khuẩn Gram dương và Gram âm có thể thay đổi tùy thuộc vào loại thuốc nhuộm được sử dụng và thời gian nhuộm. Ví dụ, crystal violet có thể xuất hiện màu xanh đậm, trong khi safranin có thể cho màu đỏ cam.
“Gram biến đổi” (Gram-variable): Một số loài vi khuẩn được gọi là “Gram biến đổi”, nghĩa là chúng có thể nhuộm cả Gram dương và Gram âm tùy thuộc vào điều kiện nuôi cấy hoặc giai đoạn phát triển. Điều này càng làm rõ thêm rằng nhuộm Gram không phải là một phương pháp phân loại hoàn hảo.
Ảnh hưởng của kháng sinh: Cấu trúc thành tế bào, yếu tố quyết định kết quả nhuộm Gram, cũng là mục tiêu của nhiều loại kháng sinh. Ví dụ, penicillin hoạt động bằng cách ức chế tổng hợp peptidoglycan, thành phần chính của thành tế bào vi khuẩn, đặc biệt hiệu quả đối với vi khuẩn Gram dương.
Một công cụ chẩn đoán nhanh: Nhuộm Gram là một xét nghiệm nhanh chóng và rẻ chóng, cung cấp thông tin có giá trị trong việc chẩn đoán sơ bộ nhiễm trùng. Kết quả nhuộm Gram có thể giúp bác sĩ nhanh chóng lựa chọn kháng sinh phù hợp trong khi chờ kết quả nuôi cấy và xác định chính xác loài vi khuẩn.