Nhuộm PAS (Periodic acid-Schiff staining/PAS staining)

Nhuộm PAS (Periodic acid-Schiff) là một kỹ thuật nhuộm hóa mô học thường được sử dụng để phát hiện polysaccharide như glycogen, glycoprotein, proteoglycan, và các phân tử giàu carbohydrate khác trong các mô. Kỹ thuật này dựa trên phản ứng của acid periodic (HIO₄) với các nhóm glycol vicinal (nhóm hydroxyl liền kề) trong các phân tử carbohydrate, tạo ra aldehyde. Các aldehyde này sau đó phản ứng với thuốc thử Schiff, tạo ra một màu đỏ tươi đặc trưng, cho phép quan sát và định vị các cấu trúc giàu carbohydrate trong mô.

Nguyên lý

Nhuộm PAS dựa trên hai phản ứng hóa học chính:

Oxy hóa bằng acid periodic: Acid periodic (HIO₄) oxy hóa các nhóm glycol vicinal (-CHOH-CHOH-) thành các nhóm aldehyde (-CHO). Phản ứng này có thể được biểu diễn như sau: -CHOH-CHOH- + HIO₄ → -CHO + -CHO + HIO₃ + H₂O
Phản ứng với thuốc thử Schiff: Thuốc thử Schiff, một dạng khử màu của fuchsin base, phản ứng đặc hiệu với các aldehyde được tạo thành, tạo ra một sản phẩm màu đỏ tươi magenta. Cơ chế chính xác của phản ứng này khá phức tạp nhưng có thể được đơn giản hóa như sự tạo thành một liên kết cộng hóa trị giữa thuốc thử Schiff và nhóm aldehyde. Màu đỏ tươi magenta này chính là tín hiệu để xác định sự hiện diện của các cấu trúc giàu carbohydrate.

Quy trình nhuộm PAS

Quy trình nhuộm PAS bao gồm các bước sau:

Cố định: Mô được cố định bằng các chất cố định như formalin 10% đệm trung tính để bảo tồn cấu trúc mô.
Oxy hóa bằng acid periodic: Các lát cắt mô được ủ trong dung dịch acid periodic (thường là 1%).
Rửa: Lát cắt được rửa bằng nước cất để loại bỏ acid periodic dư thừa.
Nhuộm bằng thuốc thử Schiff: Lát cắt được ủ trong thuốc thử Schiff.
Rửa: Lát cắt được rửa bằng nước cất để loại bỏ thuốc thử Schiff dư thừa.
Nhuộm đối lập (tùy chọn): Có thể sử dụng các phương pháp nhuộm đối lập như hematoxylin (Mayer’s hematoxylin) để nhuộm nhân tế bào, tạo sự tương phản và dễ quan sát hơn. Việc nhuộm đối lập giúp phân biệt rõ ràng các cấu trúc nhuộm PAS dương tính với các cấu trúc khác trong mô.
Khử nước và bao phủ: Lát cắt được khử nước qua các nồng độ cồn tăng dần, làm trong bằng xylen và bao phủ bằng lam kính và môi trường gắn lam để bảo quản và quan sát dưới kính hiển vi.

Ứng dụng

Nhuộm PAS được sử dụng rộng rãi trong chẩn đoán bệnh lý và nghiên cứu y sinh học, bao gồm:

Phát hiện glycogen trong gan và cơ: Xác định sự tích tụ glycogen bất thường.
Nhận dạng nấm: Thành tế bào của nấm chứa polysaccharide và nhuộm PAS dương tính.
Chẩn đoán các bệnh tích trữ glycogen: Như bệnh Pompe, bệnh McArdle.
Nghiên cứu màng đáy: Màng đáy giàu carbohydrate và nhuộm PAS dương tính.
Đánh giá tình trạng viêm: Một số tế bào viêm chứa polysaccharide và nhuộm PAS dương tính.
Phân biệt các loại ung thư: Một số loại ung thư biểu hiện sự thay đổi về hàm lượng carbohydrate.

Ưu điểm

Đặc hiệu cho polysaccharide và các phân tử giàu carbohydrate.
Dễ thực hiện và cho kết quả rõ ràng.

Nhược điểm

Có thể cho kết quả dương tính giả với một số chất khác ngoài carbohydrate, ví dụ như glycolipid, một số sắc tố, và các phân tử có nhóm aldehyde hoặc ketone tự do.
Kết quả có thể bị ảnh hưởng bởi các yếu tố kỹ thuật như thời gian ủ và nồng độ thuốc thử. Việc kiểm soát chặt chẽ các yếu tố này là cần thiết để đảm bảo tính nhất quán của kết quả.

Kiểm soát

Để đảm bảo tính chính xác của kết quả nhuộm PAS, cần thực hiện kiểm soát. Một kiểm soát dương tính (mô đã biết chứa carbohydrate, ví dụ như gan) và một kiểm soát âm tính (mô đã biết không chứa carbohydrate, hoặc xử lý lát cắt bằng amylase để tiêu hóa glycogen trước khi nhuộm) nên được thực hiện song song với mẫu thử nghiệm. Việc so sánh mẫu thử nghiệm với các kiểm soát này giúp đánh giá tính đặc hiệu của phản ứng nhuộm.

Nhuộm PAS với tiêu hóa Diastase (PAS-D)

Một biến thể quan trọng của nhuộm PAS là nhuộm PAS với tiêu hóa diastase (PAS-D). Trong kỹ thuật này, lát cắt mô được xử lý bằng diastase, một enzyme thủy phân glycogen, trước khi nhuộm PAS. Sự biến mất màu đỏ magenta sau khi xử lý diastase cho thấy sự hiện diện của glycogen trong mô ban đầu. Phản ứng này có thể được biểu diễn như sau: Glycogen + Diastase → Glucose. Nếu sau khi xử lý bằng diastase mà vẫn còn màu đỏ magenta, điều này cho thấy sự hiện diện của các polysaccharide khác không phải glycogen.

Biến thể khác của nhuộm PAS

Ngoài PAS-D, còn có một số biến thể khác của nhuộm PAS, bao gồm:

Nhuộm Alcian blue-PAS (AB-PAS): Kết hợp nhuộm Alcian blue (phát hiện mucopolysaccharide acid) với nhuộm PAS, cho phép phân biệt giữa các loại mucopolysaccharide khác nhau.
Nhuộm Periodic acid-methenamine silver (PAM): Sử dụng methenamine silver thay cho thuốc thử Schiff, tạo ra màu đen hoặc nâu đen cho các cấu trúc giàu carbohydrate. Kỹ thuật này thường được sử dụng để nhuộm màng đáy và nấm.

Hạn chế

Mặc dù nhuộm PAS là một kỹ thuật hữu ích, nhưng nó có một số hạn chế:

Độ nhạy có thể bị ảnh hưởng bởi các yếu tố như thời gian cố định và độ dày của lát cắt.
Một số chất khác ngoài carbohydrate, chẳng hạn như glycolipid và một số sắc tố, cũng có thể nhuộm PAS dương tính, dẫn đến kết quả dương tính giả. Cần kết hợp với các kỹ thuật nhuộm khác và các xét nghiệm bổ sung để đưa ra kết luận chính xác.

Lưu ý an toàn

Acid periodic là chất oxy hóa mạnh và cần được xử lý cẩn thận. Nên đeo găng tay, kính bảo hộ và làm việc trong tủ hút khi sử dụng acid periodic.
Thuốc thử Schiff chứa formaldehyde và cần được thao tác trong tủ hút.

Tóm tắt về Nhuộm PAS

Nhuộm PAS (Periodic acid-Schiff) là một kỹ thuật nhuộm hóa mô học quan trọng dùng để phát hiện polysaccharide và các phân tử giàu carbohydrate trong mô. Nguyên lý của kỹ thuật này dựa trên sự oxy hóa các nhóm glycol vicinal (-CHOH-CHOH-) thành aldehyde (-CHO) bởi acid periodic (HIO₄). Các aldehyde này sau đó phản ứng với thuốc thử Schiff, tạo ra màu đỏ magenta đặc trưng. Màu đỏ magenta này cho phép quan sát và định vị các cấu trúc chứa carbohydrate dưới kính hiển vi.

Ứng dụng của nhuộm PAS rất rộng rãi, từ việc phát hiện glycogen trong gan và cơ, nhận dạng nấm, chẩn đoán các bệnh tích trữ glycogen, đến nghiên cứu màng đáy và đánh giá tình trạng viêm. Nhuộm PAS với tiêu hóa diastase (PAS-D) là một biến thể quan trọng giúp phân biệt glycogen với các polysaccharide khác. Nếu màu đỏ magenta biến mất sau khi xử lý bằng diastase, điều này xác nhận sự hiện diện của glycogen.

Việc thực hiện kiểm soát dương tính và âm tính là rất quan trọng để đảm bảo tính chính xác của kết quả nhuộm PAS. Cần lưu ý rằng một số chất khác ngoài carbohydrate cũng có thể nhuộm PAS dương tính, do đó cần thận trọng khi diễn giải kết quả. Cuối cùng, cần tuân thủ các biện pháp an toàn khi làm việc với acid periodic và thuốc thử Schiff do tính chất hóa học của chúng.

Tài liệu tham khảo:

Bancroft, J. D., & Gamble, M. (2008). Theory and practice of histological techniques. Churchill Livingstone.
Carson, F. L., & Hladik, C. (2009). Histotechnology: A self-instructional text. ASCP Press.
Kiernan, J. A. (2008). Histological and histochemical methods: Theory and practice. Scion Publishing.

Câu hỏi và Giải đáp

Tại sao việc cố định mô lại quan trọng trước khi thực hiện nhuộm PAS?

Trả lời: Cố định mô bằng các chất như formalin giúp bảo tồn cấu trúc mô, ngăn chặn sự phân hủy của các thành phần tế bào, bao gồm cả carbohydrate. Điều này đảm bảo rằng các carbohydrate vẫn ở đúng vị trí và có thể được phát hiện chính xác bằng nhuộm PAS.

Ngoài acid periodic (HIO₄), còn chất oxy hóa nào khác có thể được sử dụng trong nhuộm PAS không?

Trả lời: Mặc dù acid periodic là chất oxy hóa được sử dụng phổ biến nhất, potassium permanganate (KMnO₄) cũng có thể được sử dụng như một chất oxy hóa thay thế trong một số trường hợp. Tuy nhiên, KMnO₄ có thể gây ra nền nhuộm cao hơn, đòi hỏi phải tối ưu hóa quy trình.

Làm thế nào để phân biệt glycogen với các polysaccharide khác bằng nhuộm PAS?

Trả lời: Sử dụng phương pháp nhuộm PAS với tiêu hóa diastase (PAS-D). Diastase là một enzyme thủy phân glycogen. Nếu màu đỏ magenta biến mất sau khi xử lý bằng diastase, điều này chứng tỏ sự hiện diện của glycogen. Nếu màu đỏ magenta vẫn còn, đó là dấu hiệu của các polysaccharide khác không phải glycogen.

Tại sao thuốc thử Schiff phải được bảo quản trong điều kiện kín, tránh ánh sáng?

Trả lời: Thuốc thử Schiff dễ bị oxy hóa bởi không khí và ánh sáng, dẫn đến sự phục hồi màu và mất khả năng phản ứng đặc hiệu với aldehyde. Bảo quản trong điều kiện kín, tránh ánh sáng giúp duy trì tính ổn định và hiệu quả của thuốc thử.

Nhuộm PAS có những hạn chế nào và làm thế nào để khắc phục những hạn chế đó?

Trả lời: Một số hạn chế của nhuộm PAS bao gồm khả năng cho kết quả dương tính giả với một số chất không phải carbohydrate và độ nhạy có thể bị ảnh hưởng bởi các yếu tố kỹ thuật. Để khắc phục những hạn chế này, cần thực hiện kiểm soát dương tính và âm tính, tối ưu hóa các bước trong quy trình nhuộm, và kết hợp với các kỹ thuật nhuộm khác để xác nhận kết quả. Ví dụ, kết hợp nhuộm PAS với các phương pháp hóa mô miễn dịch có thể giúp tăng tính đặc hiệu trong việc xác định các loại carbohydrate cụ thể.

Một số điều thú vị về Nhuộm PAS

Thuốc thử Schiff ban đầu được phát triển để nhuộm nhân tế bào: Hugo Schiff, một nhà hóa học người Đức, đã phát triển thuốc thử này vào năm 1866. Ban đầu, nó được sử dụng để nhuộm nhân tế bào, nhưng sau đó được điều chỉnh để sử dụng trong nhuộm PAS.
Màu magenta của nhuộm PAS không phải là màu của thuốc thử Schiff: Thuốc thử Schiff ở dạng khử màu thì không màu hoặc có màu vàng nhạt. Màu magenta đặc trưng chỉ xuất hiện sau khi phản ứng với aldehyde.
Nhuộm PAS có thể được sử dụng để nhuộm các cấu trúc trong thực vật: Mặc dù thường được sử dụng trong mô động vật, nhuộm PAS cũng có thể được áp dụng để nhuộm thành tế bào thực vật và các cấu trúc chứa carbohydrate khác.
Kỹ thuật nhuộm PAS đã được sử dụng trong hơn 70 năm: Kỹ thuật này được phát triển vào giữa thế kỷ 20 và vẫn là một công cụ quan trọng trong nghiên cứu và chẩn đoán bệnh lý cho đến ngày nay.
“PAS” là viết tắt của Periodic Acid-Schiff, nhưng đôi khi bị hiểu nhầm là “Periodic Acid-Silver”: Điều này có thể do sự tồn tại của kỹ thuật nhuộm tương tự là Periodic acid-methenamine silver (PAM), sử dụng bạc để tạo màu.
Sự đậm nhạt của màu magenta trong nhuộm PAS phản ánh nồng độ carbohydrate: Màu đậm hơn cho thấy nồng độ carbohydrate cao hơn trong mô.
Nhuộm PAS được sử dụng trong pháp y: Nó có thể được sử dụng để xác định sự hiện diện của glycogen trong các mẫu mô, giúp xác định thời gian tử vong.
Nhuộm PAS có thể được kết hợp với các kỹ thuật nhuộm khác: Ví dụ, nhuộm PAS kết hợp với nhuộm Alcian blue (AB-PAS) cho phép phân biệt giữa các loại mucopolysaccharide khác nhau.