Northern blot (Northern blot)

Northern blot là một kỹ thuật được sử dụng rộng rãi trong sinh học phân tử để phát hiện RNA đặc hiệu trong một mẫu. Kỹ thuật này cho phép nghiên cứu biểu hiện gen bằng cách xác định kích thước và hàm lượng của một RNA cụ thể. Nó được đặt tên theo Southern blot, một kỹ thuật phát hiện DNA, và được phát triển bởi James Alwine, David Kemp, và George Stark vào năm 1977.

Nguyên lý

Northern blot dựa trên các nguyên lý sau:

Tách RNA: RNA tổng số từ mẫu sinh học (tế bào, mô) được chiết xuất và tách theo kích thước bằng điện di trên gel agarose. Gel agarose có tính chất xốp, cho phép các phân tử RNA di chuyển qua gel với tốc độ khác nhau phụ thuộc vào kích thước của chúng. Phân tử RNA nhỏ hơn di chuyển nhanh hơn và xa hơn so với phân tử RNA lớn hơn.
Chuyển RNA: RNA được chuyển từ gel agarose sang một màng rắn (thường là màng nylon hoặc nitrocellulose). Quá trình này bảo tồn sự sắp xếp của các dải RNA trên gel. Việc chuyển RNA có thể thực hiện bằng phương pháp mao dẫn hoặc điện di.
Lai với đầu dò: Màng được ủ với một đầu dò (probe) đã được đánh dấu phóng xạ hoặc huỳnh quang. Đầu dò là một đoạn DNA hoặc RNA mạch đơn bổ sung với trình tự RNA đích mà ta muốn phát hiện. Đầu dò có thể được đánh dấu bằng đồng vị phóng xạ (như $^{32}$P) hoặc bằng các phương pháp không phóng xạ. Quá trình lai (hybridization) xảy ra khi đầu dò liên kết đặc hiệu với RNA đích trên màng. Điều kiện lai (nhiệt độ, nồng độ muối) được tối ưu hóa để đảm bảo sự liên kết đặc hiệu.
Phát hiện: RNA đích được phát hiện bằng cách ghi nhận tín hiệu từ đầu dò đã được đánh dấu. Nếu đầu dò được đánh dấu phóng xạ, màng được đặt lên phim X-quang để ghi nhận tín hiệu. Nếu đầu dò được đánh dấu huỳnh quang, tín hiệu được phát hiện bằng các thiết bị đặc hiệu. Vị trí và cường độ của tín hiệu cho biết kích thước và lượng RNA đích tương ứng. Cường độ tín hiệu tỷ lệ thuận với lượng RNA đích trong mẫu.

Các bước thực hiện

Các bước thực hiện kỹ thuật Northern blot bao gồm:

Tách chiết RNA: RNA tổng số được tách chiết từ mẫu sinh học bằng các phương pháp thích hợp, ví dụ sử dụng Trizol. Chất lượng RNA cần được kiểm tra trước khi thực hiện các bước tiếp theo.
Điện di trên gel agarose: RNA được chạy trên gel agarose (thường là 1-2%) để tách theo kích thước. Gel thường được nhuộm bằng ethidium bromide hoặc các chất nhuộm an toàn hơn như SYBR Green để quan sát RNA dưới tia UV. Điện di được thực hiện trong dung dịch đệm chứa formaldehyde để biến tính RNA.
Chuyển RNA lên màng: RNA từ gel được chuyển lên màng (màng nylon hoặc nitrocellulose) bằng phương pháp blotting. Các phương pháp thường dùng bao gồm capillary blotting hoặc electroblotting. Đối với capillary blotting, dung dịch chuyển sẽ di chuyển từ dưới lên trên, mang theo RNA và lắng đọng lên màng.
Cố định RNA trên màng: RNA được cố định trên màng bằng cách sấy hoặc chiếu tia UV. Việc cố định này giúp RNA liên kết chặt chẽ với màng và ngăn ngừa sự rửa trôi trong các bước tiếp theo.
Tiền lai: Màng được ủ với dung dịch tiền lai (prehybridization) chứa các chất như salmon sperm DNA hoặc tRNA để chặn các vị trí liên kết không đặc hiệu, giúp giảm nhiễu nền.
Lai với đầu dò: Màng được ủ với đầu dò (probe) đã được đánh dấu (phóng xạ hoặc huỳnh quang) trong dung dịch lai ở nhiệt độ và thời gian thích hợp. Quá trình lai cho phép đầu dò liên kết đặc hiệu với RNA đích trên màng.
Rửa màng: Màng được rửa nhiều lần với các dung dịch rửa có nồng độ muối và nhiệt độ tăng dần để loại bỏ đầu dò không liên kết đặc hiệu, giúp tăng độ đặc hiệu của tín hiệu.
Phát hiện: RNA đích được phát hiện bằng cách ghi nhận tín hiệu từ đầu dò. Nếu đầu dò được đánh dấu phóng xạ, màng được đặt lên phim X-quang (autoradiography) để ghi nhận tín hiệu. Nếu đầu dò được đánh dấu huỳnh quang, tín hiệu được phát hiện bằng các thiết bị đặc hiệu như máy quét huỳnh quang.

Ứng dụng

Nghiên cứu biểu hiện gen: Xác định mức độ biểu hiện của một gen cụ thể trong các điều kiện khác nhau (ví dụ: các giai đoạn phát triển, các mô khác nhau, xử lý với các chất khác nhau).
Phân tích kích thước và số lượng bản sao RNA: Northern blot cho phép xác định kích thước của RNA đích và ước lượng số lượng bản sao RNA trong mẫu.
Phát hiện các đột biến hoặc biến đổi trong RNA: Các đột biến hoặc biến đổi trong trình tự RNA có thể ảnh hưởng đến kích thước của RNA hoặc khả năng lai với đầu dò, do đó có thể được phát hiện bằng Northern blot.
Chẩn đoán một số bệnh lý: Northern blot có thể được sử dụng để phát hiện sự biểu hiện bất thường của RNA liên quan đến một số bệnh lý.

Ưu điểm

Đặc hiệu cao: Cho phép phát hiện RNA đặc hiệu nhờ vào sự lai đặc hiệu giữa đầu dò và RNA đích.
Định lượng được: Cho phép ước lượng lượng RNA đích trong mẫu dựa vào cường độ tín hiệu.
Cung cấp thông tin về kích thước RNA: Cho phép xác định kích thước của RNA đích dựa vào vị trí của dải trên màng.

Nhược điểm

Tốn thời gian và công sức: Kỹ thuật Northern blot đòi hỏi nhiều bước và thời gian thực hiện khá dài, thường mất vài ngày.
Độ nhạy thấp hơn so với một số kỹ thuật khác như RT-PCR: Northern blot ít nhạy hơn RT-PCR, đặc biệt là khi lượng RNA đích trong mẫu thấp.
Cần phải cẩn thận trong quá trình thao tác để tránh sự phân hủy RNA: RNA dễ bị phân hủy bởi RNase, do đó cần phải cẩn thận trong quá trình thao tác và sử dụng các dung dịch và thiết bị không chứa RNase.
Khả năng định lượng bán định lượng: Mặc dù có thể ước lượng lượng RNA, nhưng độ chính xác định lượng của Northern blot không cao bằng RT-qPCR.

So sánh với Southern blot và Western blot

Đặc điểm	Northern blot	Southern blot	Western blot
Phân tử đích	RNA	DNA	Protein
Phương pháp tách	Điện di gel agarose	Điện di gel agarose	Điện di gel SDS-PAGE
Đầu dò	DNA hoặc RNA đánh dấu	DNA đánh dấu	Kháng thể đánh dấu

Northern blot là một kỹ thuật quan trọng trong sinh học phân tử để nghiên cứu biểu hiện gen. Mặc dù kỹ thuật này đòi hỏi nhiều thời gian và công sức, nhưng nó cung cấp thông tin quan trọng về kích thước và lượng RNA đặc hiệu, giúp hiểu rõ hơn về chức năng của gen. Tuy nhiên, do độ nhạy thấp hơn và tốn kém hơn so với RT-PCR, Northern blot thường được sử dụng khi cần xác định kích thước RNA hoặc khi RT-PCR không khả thi.

Các yếu tố ảnh hưởng đến kết quả Northern blot

Chất lượng RNA: RNA nguyên vẹn, không bị phân hủy là yếu tố quan trọng để có kết quả Northern blot chính xác. Sự phân hủy RNA có thể dẫn đến tín hiệu yếu hoặc không đặc hiệu.
Lựa chọn đầu dò: Đầu dò phải đặc hiệu cho RNA đích và có độ dài thích hợp. Đầu dò quá ngắn có thể không đủ đặc hiệu, trong khi đầu dò quá dài có thể lai chéo với các RNA khác.
Điều kiện lai: Nhiệt độ và nồng độ muối trong dung dịch lai ảnh hưởng đến hiệu quả lai. Điều kiện lai tối ưu cần được xác định cho từng đầu dò.
Thời gian phơi sáng: Thời gian phơi sáng phim X-quang hoặc thời gian thu nhận tín hiệu huỳnh quang ảnh hưởng đến độ nhạy của kỹ thuật. Thời gian phơi sáng quá ngắn có thể dẫn đến tín hiệu yếu, trong khi thời gian phơi sáng quá dài có thể dẫn đến nhiễu nền cao.

Các biến thể của Northern blot

Reverse Northern blot: Trong kỹ thuật này, DNA được cố định trên màng, và RNA được sử dụng làm đầu dò. Phương pháp này thường được dùng để nghiên cứu sự biểu hiện của một tập hợp các gen.
RNase protection assay (RPA): Kỹ thuật này sử dụng một đầu dò RNA đánh dấu để lai với RNA đích. Sau đó, RNase được sử dụng để phân hủy RNA không lai, và RNA lai được bảo vệ sẽ được phát hiện. RPA có độ nhạy cao hơn Northern blot.

So sánh giữa Northern blot và RT-PCR

Đặc điểm	Northern blot	RT-PCR
Độ nhạy	Thấp hơn	Cao hơn
Định lượng	Bán định lượng	Định lượng (đặc biệt là qPCR)
Thông tin về kích thước RNA	Có	Không
Khả năng phát hiện các dạng RNA khác nhau (splice variants)	Có	Hạn chế
Độ phức tạp	Cao	Thấp
Chi phí	Cao	Thấp hơn

Phân tích kết quả

Kết quả Northern blot được phân tích bằng cách quan sát các dải RNA trên phim X-quang hoặc ảnh huỳnh quang. Kích thước của dải RNA được xác định bằng cách so sánh với thang chuẩn phân tử lượng. Cường độ của dải RNA phản ánh lượng RNA đích trong mẫu. Phần mềm phân tích ảnh có thể được sử dụng để định lượng cường độ tín hiệu. Cần phân tích kết quả kết hợp với các kiểm soát (control) để đảm bảo tính chính xác của thí nghiệm.

Tóm tắt về Northern blot

Northern blot là một kỹ thuật mạnh mẽ dùng để phát hiện và phân tích RNA. Kỹ thuật này cho phép các nhà nghiên cứu xác định kích thước và lượng RNA cụ thể trong một mẫu sinh học. Nguyên lý của Northern blot dựa trên sự tách RNA theo kích thước bằng điện di, chuyển RNA lên màng, lai với đầu dò đặc hiệu và phát hiện tín hiệu. Chất lượng RNA, lựa chọn đầu dò và điều kiện lai là những yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến kết quả.

So với RT-PCR, Northern blot có độ nhạy thấp hơn nhưng cung cấp thông tin về kích thước RNA và khả năng phát hiện các dạng RNA khác nhau (splice variants). Trong khi RT-PCR cho kết quả định lượng chính xác hơn và có độ nhạy cao hơn, Northern blot vẫn có giá trị trong một số ứng dụng cụ thể. Việc lựa chọn giữa Northern blot và RT-PCR phụ thuộc vào mục tiêu nghiên cứu và nguồn lực sẵn có.

Các biến thể của Northern blot, như reverse Northern blot và RNase protection assay, mở rộng ứng dụng của kỹ thuật này. Tuy nhiên, cần lưu ý rằng Northern blot là một kỹ thuật phức tạp và tốn thời gian, đòi hỏi kỹ năng và kinh nghiệm. Việc tuân thủ đúng quy trình và kiểm soát chặt chẽ các yếu tố ảnh hưởng là rất quan trọng để đảm bảo kết quả chính xác và đáng tin cậy. Cuối cùng, việc phân tích kết quả Northern blot cần được thực hiện cẩn thận, kết hợp với các kiến thức sinh học phân tử để đưa ra kết luận chính xác.

Tài liệu tham khảo:

Alwine, J. C., Kemp, D. J., & Stark, G. R. (1977). Method for detection of specific RNAs in agarose gels by transfer to diazobenzyloxymethyl-paper and hybridization with DNA probes. Proceedings of the National Academy of Sciences, 74(12), 5350–5354.
Sambrook, J., & Russell, D. W. (2001). Molecular cloning: A laboratory manual (3rd ed.). Cold Spring Harbor Laboratory Press.

Câu hỏi và Giải đáp

Tại sao việc sử dụng formaldehyde trong quá trình điện di RNA trên gel agarose lại quan trọng trong Northern blot?

Trả lời: Formaldehyde đóng vai trò quan trọng trong việc biến tính RNA. RNA có thể tạo cấu trúc bậc hai phức tạp do sự bắt cặp base giữa các vùng bổ sung trong cùng một phân tử. Formaldehyde ngăn chặn sự bắt cặp base này, đảm bảo RNA tồn tại ở dạng mạch thẳng. Điều này cho phép RNA di chuyển trên gel agarose theo kích thước thực tế của nó, tạo ra kết quả chính xác hơn.

Ngoài màng nylon và nitrocellulose, còn loại màng nào khác có thể được sử dụng trong Northern blot và ưu nhược điểm của chúng là gì?

Trả lời: Màng nylon tích điện dương cũng có thể được sử dụng.

Ưu điểm của màng nylon: Độ bền cơ học cao, khả năng liên kết RNA tốt, có thể tái sử dụng nhiều lần.
Nhược điểm của màng nylon: Có thể gây ra nền cao hơn so với nitrocellulose.
Màng Nitrocellulose: Chi phí thấp hơn, nền thấp, dễ sử dụng. Tuy nhiên độ bền cơ học kém hơn nylon.

Làm thế nào để thiết kế một đầu dò hiệu quả cho Northern blot?

Trả lời: Một đầu dò hiệu quả cần đặc hiệu, có độ dài thích hợp (200-500 base) và không có cấu trúc bậc hai phức tạp. Đầu dò có thể là DNA hoặc RNA, được đánh dấu phóng xạ hoặc huỳnh quang. Cần kiểm tra tính đặc hiệu của đầu dò bằng cách so sánh trình tự với cơ sở dữ liệu để tránh lai chéo với các RNA khác.

Kỹ thuật nào nhạy hơn giữa Northern blot và dot blot trong việc phát hiện RNA? Giải thích tại sao.

Trả lời: Dot blot nhạy hơn Northern blot. Trong dot blot, RNA được chấm trực tiếp lên màng, không qua bước điện di. Do đó, toàn bộ RNA trong mẫu được tập trung tại một điểm, làm tăng tín hiệu lai với đầu dò. Ngược lại, trong Northern blot, RNA được phân tách theo kích thước trên gel, dẫn đến sự phân bố RNA trên một diện tích lớn hơn, làm giảm tín hiệu tại mỗi vị trí.

Ngoài việc nghiên cứu biểu hiện gen, Northern blot còn có ứng dụng nào khác trong nghiên cứu sinh học?

Trả lời: Northern blot còn được sử dụng để:

Phân tích kích thước và số lượng bản sao RNA: Xác định kích thước chính xác của transcript RNA và số lượng bản sao của nó trong tế bào.
Phát hiện các đột biến hoặc biến đổi trong RNA: Ví dụ, Northern blot có thể phát hiện các đột biến gây thay đổi kích thước của transcript RNA.
Nghiên cứu sự phân hủy RNA: Đánh giá mức độ phân hủy RNA trong mẫu bằng cách quan sát hình dạng và kích thước của các dải RNA.
Nghiên cứu sự cắt nối (splicing) RNA: Phát hiện các dạng RNA khác nhau (splice variants) của cùng một gen.

Một số điều thú vị về Northern blot

Tên gọi “Northern blot” thực ra không liên quan đến phương hướng địa lý: Kỹ thuật này được đặt tên theo Southern blot, một kỹ thuật tương tự dùng để phát hiện DNA, được phát triển bởi Edwin Southern. Tên gọi “Northern” chỉ đơn giản là một cách chơi chữ và không mang ý nghĩa đặc biệt nào khác. Sau đó, Western blot, một kỹ thuật phát hiện protein, cũng được đặt tên theo cách tương tự, tạo thành bộ ba kỹ thuật “Southern”, “Northern”, và “Western” blot. Thậm chí còn có một kỹ thuật ít phổ biến hơn gọi là “Eastern blot”, mặc dù nó không có một định nghĩa tiêu chuẩn.
Northern blot từng là “tiêu chuẩn vàng” để nghiên cứu biểu hiện gen: Trước khi RT-PCR ra đời và trở nên phổ biến, Northern blot là kỹ thuật chủ yếu được sử dụng để định lượng mRNA và nghiên cứu biểu hiện gen. Kỹ thuật này cho phép các nhà khoa học quan sát trực tiếp kích thước và lượng RNA, cung cấp thông tin quan trọng về hoạt động của gen.
Northern blot vẫn còn hữu dụng trong một số trường hợp cụ thể: Mặc dù RT-PCR đã thay thế Northern blot trong nhiều ứng dụng, kỹ thuật này vẫn còn giá trị trong một số nghiên cứu đặc biệt. Ví dụ, Northern blot có thể được sử dụng để phát hiện các dạng RNA khác nhau (splice variants) của cùng một gen, điều mà RT-PCR khó thực hiện được. Nó cũng hữu ích để xác định kích thước chính xác của transcript RNA.
Northern blot có thể được sử dụng để nghiên cứu sự phân hủy RNA: Bằng cách quan sát hình dạng và kích thước của các dải RNA trên màng, các nhà nghiên cứu có thể đánh giá mức độ phân hủy RNA trong mẫu. Điều này cung cấp thông tin quan trọng về chất lượng RNA và có thể ảnh hưởng đến việc giải thích kết quả.
Northern blot có thể được thực hiện với nhiều loại mẫu sinh học khác nhau: Kỹ thuật này không chỉ giới hạn ở việc nghiên cứu RNA từ tế bào nuôi cấy. Nó có thể được sử dụng để phân tích RNA từ nhiều nguồn khác nhau, bao gồm mô động vật, mô thực vật, vi khuẩn và virus.