PCR lồng (Nested PCR)

Nguyên lý

Nested PCR hoạt động dựa trên nguyên tắc sử dụng hai cặp mồi và hai vòng khuếch đại PCR liên tiếp để tăng độ đặc hiệu và độ nhạy. Cụ thể:

• Vòng PCR thứ nhất: Sử dụng một cặp mồi “ngoài” (outer primers) để khuếch đại một vùng DNA lớn hơn vùng đích mong muốn. Vùng này bao gồm cả vùng đích mà ta muốn khuếch đại ở vòng PCR thứ hai. Sản phẩm của vòng PCR thứ nhất đóng vai trò như khuôn mẫu cho vòng PCR thứ hai.
• Vòng PCR thứ hai: Sử dụng một cặp mồi “trong” (inner primers), được thiết kế để bắt cặp với các trình tự nằm bên trong sản phẩm PCR của vòng thứ nhất. Cặp mồi “trong” này đặc hiệu hơn cho vùng đích mong muốn và khuếch đại một đoạn DNA ngắn hơn nằm bên trong sản phẩm của vòng 1. Sản phẩm của vòng PCR thứ hai chính là đoạn DNA đích được khuếch đại với độ đặc hiệu cao. Việc sử dụng cặp mồi thứ hai giúp loại bỏ các sản phẩm khuếch đại không đặc hiệu có thể xuất hiện ở vòng PCR thứ nhất, từ đó làm tăng độ đặc hiệu của phản ứng.

Ưu điểm

Nested PCR mang lại một số ưu điểm so với PCR thông thường:

• Tăng độ đặc hiệu: Do sử dụng hai cặp mồi, khả năng khuếch đại các sản phẩm không đặc hiệu (off-target amplification) giảm đáng kể. Mồi “trong” chỉ khuếch đại sản phẩm của vòng PCR thứ nhất, loại bỏ hầu hết các sản phẩm không mong muốn được tạo ra ở vòng đầu.
• Tăng độ nhạy: Nested PCR có thể khuếch đại DNA đích từ một lượng mẫu ban đầu rất nhỏ, ngay cả khi DNA mẫu bị phân hủy một phần hoặc lẫn với các tạp chất ức chế PCR. Điều này là do vòng khuếch đại đầu tiên làm tăng lượng DNA khuôn mẫu cho vòng thứ hai, cho phép phát hiện các trình tự DNA có số lượng ban đầu rất thấp.
• Giảm nhiễu nền: Việc sử dụng hai vòng PCR giúp giảm nhiễu nền, làm cho việc phát hiện sản phẩm PCR đích dễ dàng hơn.

Nhược điểm

Mặc dù có nhiều ưu điểm, Nested PCR cũng có một số nhược điểm cần lưu ý:

• Tốn thời gian và công sức: Do phải thực hiện hai vòng PCR riêng biệt, Nested PCR mất nhiều thời gian hơn so với PCR thông thường.
• Nguy cơ nhiễm bẩn: Việc mở ống nghiệm sau vòng PCR thứ nhất để chuyển sản phẩm sang vòng thứ hai làm tăng nguy cơ nhiễm bẩn chéo, dẫn đến kết quả dương tính giả. Cần thao tác cẩn thận trong môi trường sạch, sử dụng các pipette riêng biệt và thay đầu tip sau mỗi lần thao tác để giảm thiểu nguy cơ này.

Ứng dụng

Nested PCR được sử dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực, bao gồm:

• Chẩn đoán bệnh truyền nhiễm: Phát hiện các tác nhân gây bệnh như vi khuẩn, virus, ký sinh trùng với độ nhạy cao, đặc biệt là trong trường hợp số lượng tác nhân gây bệnh trong mẫu rất thấp.
• Phân tích pháp y: Khuếch đại DNA từ các mẫu vật nhỏ hoặc bị phân hủy để xác định danh tính cá nhân.
• Nghiên cứu di truyền: Khuếch đại các đoạn DNA đặc hiệu để phân tích đột biến gen, đa hình di truyền, và các biến thể di truyền khác.
• Kiểm tra thực phẩm: Phát hiện các sinh vật gây bệnh hoặc biến đổi gen trong thực phẩm. Nested PCR cho phép phát hiện sự nhiễm bẩn ở mức độ rất thấp, đảm bảo an toàn thực phẩm.

So sánh với PCR thông thường

Bảng sau đây so sánh Nested PCR với PCR thông thường:

Ví dụ

Giả sử ta muốn khuếch đại đoạn DNA đích X. Trong PCR lồng:

• Vòng 1: Sử dụng mồi A và B để khuếch đại đoạn DNA lớn hơn chứa X.
• Vòng 2: Sử dụng mồi C và D (nằm bên trong đoạn được khuếch đại bởi A và B) để khuếch đại đặc hiệu đoạn X.

Tóm lại

Nested PCR là một kỹ thuật mạnh mẽ để khuếch đại DNA với độ đặc hiệu và độ nhạy cao. Tuy nhiên, cần lưu ý về nguy cơ nhiễm bẩn và thời gian thực hiện dài hơn so với PCR thông thường.

Các biến thể của Nested PCR

Ngoài phương pháp Nested PCR cổ điển được mô tả ở trên, còn có một số biến thể khác được phát triển để cải thiện hiệu suất và giảm thiểu nhược điểm:

• Semi-nested PCR: Chỉ sử dụng một mồi mới trong vòng PCR thứ hai, kết hợp với một mồi từ vòng thứ nhất. Phương pháp này giảm nguy cơ nhiễm bẩn và tiết kiệm thời gian hơn so với Nested PCR truyền thống.
• Multiplex Nested PCR: Sử dụng nhiều cặp mồi “trong” trong vòng PCR thứ hai để khuếch đại đồng thời nhiều đoạn DNA đích khác nhau. Kỹ thuật này hữu ích trong việc chẩn đoán nhiều tác nhân gây bệnh cùng một lúc.
• Real-time Nested PCR: Kết hợp Nested PCR với kỹ thuật real-time PCR để theo dõi quá trình khuếch đại DNA trong thời gian thực. Phương pháp này cho phép định lượng DNA đích một cách chính xác và nhanh chóng.

Thiết kế mồi cho Nested PCR

Việc thiết kế mồi là bước quan trọng nhất để đảm bảo tính đặc hiệu và hiệu quả của Nested PCR. Một số nguyên tắc cần lưu ý khi thiết kế mồi:

• Mồi “ngoài”: Nên thiết kế để bắt cặp với vùng DNA bảo tồn, nằm ở hai bên vùng đích. Khoảng cách giữa hai mồi “ngoài” không nên quá lớn (tối ưu khoảng 500-1500 bp).
• Mồi “trong”: Nên thiết kế để bắt cặp với vùng DNA nằm hoàn toàn bên trong sản phẩm PCR của vòng thứ nhất. Khoảng cách giữa hai mồi “trong” thường nhỏ hơn khoảng cách giữa hai mồi “ngoài” (tối ưu khoảng 100-500 bp).
• Nhiệt độ nóng chảy (Tm): Nhiệt độ nóng chảy của mồi “trong” nên cao hơn nhiệt độ nóng chảy của mồi “ngoài” để đảm bảo tính đặc hiệu.
• Kiểm tra tính đặc hiệu: Nên sử dụng các công cụ sinh tin học để kiểm tra tính đặc hiệu của mồi và tránh bắt cặp chéo với các vùng DNA khác trong bộ gen.

Tối ưu hóa Nested PCR

Giống như PCR thông thường, Nested PCR cũng cần được tối ưu hóa để đạt hiệu quả cao nhất. Một số yếu tố cần được tối ưu hóa bao gồm:

• Nồng độ Mg²⁺: Nồng độ ion Mg²⁺ ảnh hưởng đến hoạt động của enzyme DNA polymerase.
• Nhiệt độ ủ: Nhiệt độ ủ cần được tối ưu hóa cho từng cặp mồi để đảm bảo sự bắt cặp đặc hiệu.
• Số chu kỳ: Số chu kỳ PCR cần được điều chỉnh để tránh sự khuếch đại quá mức và giảm thiểu sản phẩm không đặc hiệu.