1. Đánh dấu: Các tế bào được đánh dấu bằng các kháng thể huỳnh quang đặc hiệu, liên kết với các protein bề mặt hoặc các phân tử nội bào. Mỗi loại kháng thể gắn với một chất nhuộm huỳnh quang khác nhau, cho phép phân biệt nhiều loại tế bào cùng lúc. Việc lựa chọn kháng thể và chất nhuộm huỳnh quang phụ thuộc vào loại tế bào và phân tử cần phân tích.
2. Đưa mẫu vào dòng chảy: Hỗn hợp tế bào được đưa vào một dòng chất lỏng (thường là dung dịch đệm) tạo thành một dòng tế bào đơn lẻ. Dòng chảy này đảm bảo các tế bào đi qua chùm tia laser một cách riêng lẻ, cho phép đo lường chính xác tín hiệu huỳnh quang của từng tế bào.
3. Chiếu tia laser: Dòng tế bào đơn lẻ đi qua một hoặc nhiều chùm tia laser. Khi laser chiếu vào tế bào, chất nhuộm huỳnh quang bị kích thích và phát ra ánh sáng huỳnh quang ở bước sóng đặc trưng. Bước sóng kích thích và phát xạ của mỗi chất nhuộm huỳnh quang là khác nhau, cho phép phân biệt các tín hiệu huỳnh quang khác nhau.
4. Đo lường tín hiệu huỳnh quang và tán xạ: Các bộ tách sóng quang học và bộ dò quang điện (PMT – Photomultiplier tubes) thu thập ánh sáng tán xạ (forward scatter – FSC và side scatter – SSC) và ánh sáng huỳnh quang phát ra. FSC cung cấp thông tin về kích thước tế bào, trong khi SSC cung cấp thông tin về độ hạt/độ phức tạp bên trong tế bào. Ánh sáng huỳnh quang cho biết sự hiện diện và lượng của các phân tử được đánh dấu. Sự kết hợp giữa FSC, SSC và tín hiệu huỳnh quang cho phép phân biệt các quần thể tế bào khác nhau.
5. Phân tích và phân loại: Dữ liệu được thu thập bởi các PMT được chuyển đổi thành tín hiệu điện tử và được phân tích bởi phần mềm máy tính. Dựa trên cường độ huỳnh quang và tín hiệu tán xạ, máy tính có thể xác định các quần thể tế bào khác nhau. Đối với việc phân loại, dòng tế bào được chia thành các giọt nhỏ. Các giọt chứa tế bào mong muốn được tích điện (+ hoặc -) và sau đó được làm lệch hướng bởi một điện trường vào các ống thu thập riêng biệt. Quá trình này cho phép phân lập các quần thể tế bào cụ thể để nghiên cứu thêm.
Ứng dụng và ưu nhược điểm của FACS
FACS có nhiều ứng dụng quan trọng trong nghiên cứu y sinh và khoa học sự sống. Một số ứng dụng tiêu biểu bao gồm:
- Miễn dịch học: Phân tích các quần thể tế bào miễn dịch khác nhau (ví dụ: tế bào T, tế bào B, tế bào NK), nghiên cứu sự biểu hiện của các marker bề mặt tế bào, đánh giá chức năng tế bào và phân tích đáp ứng miễn dịch.
- Ung thư học: Xác định và phân lập các tế bào ung thư, nghiên cứu sự di căn ung thư, đánh giá hiệu quả của các phương pháp điều trị ung thư và phát triển các liệu pháp miễn dịch ung thư.
- Sinh học tế bào: Nghiên cứu chu kỳ tế bào, apoptosis (chết tế bào theo chương trình), quá trình biệt hóa tế bào và các quá trình tế bào khác. FACS cho phép theo dõi sự thay đổi của các marker tế bào trong các quá trình này.
- Kỹ thuật di truyền: Phân loại các tế bào đã được biến đổi gen, lựa chọn các tế bào biểu hiện gen mong muốn và nghiên cứu hiệu quả của việc chuyển gen.
- Chẩn đoán lâm sàng: Đếm số lượng tế bào lympho trong máu, phát hiện các bất thường về tế bào máu và chẩn đoán các bệnh lý liên quan đến hệ miễn dịch.
Ưu điểm của FACS:
- Phân tích và phân loại đồng thời nhiều đặc điểm của tế bào: FACS có thể đồng thời phân tích nhiều marker bề mặt và nội bào, cung cấp thông tin toàn diện về từng tế bào.
- Độ chính xác và tốc độ cao: FACS có thể phân tích và phân loại hàng ngàn tế bào mỗi giây với độ chính xác cao.
- Khả năng phân lập các quần thể tế bào tinh khiết: FACS cho phép phân lập các quần thể tế bào cụ thể với độ tinh khiết cao, phục vụ cho các nghiên cứu tiếp theo.
Nhược điểm của FACS:
- Chi phí thiết bị và vận hành cao: Máy FACS và các chất nhuộm huỳnh quang có chi phí cao, đòi hỏi đầu tư đáng kể.
- Yêu cầu kỹ thuật viên có kinh nghiệm: Vận hành và phân tích dữ liệu FACS yêu cầu kỹ thuật viên được đào tạo chuyên sâu.
- Tế bào cần ở dạng huyền phù: FACS yêu cầu tế bào ở dạng huyền phù, điều này có thể hạn chế việc phân tích một số loại mô rắn.
So sánh FACS và cytometry dòng chảy
FACS là một dạng cytometry dòng chảy chuyên biệt, cho phép phân loại tế bào dựa trên các đặc điểm được phân tích. Cytometry dòng chảy (flow cytometry) phân tích các đặc điểm của tế bào khi chúng đi qua một chùm tia laser, cung cấp thông tin về kích thước, độ hạt và biểu hiện protein của tế bào. Tuy nhiên, cytometry dòng chảy không phân loại các tế bào. Có thể hiểu FACS là một bước tiến xa hơn của cytometry dòng chảy, bổ sung khả năng phân lập các quần thể tế bào quan tâm sau khi phân tích. Về cơ bản, mọi máy FACS đều có thể thực hiện chức năng của một máy cytometry dòng chảy, nhưng không phải máy cytometry dòng chảy nào cũng có khả năng phân loại tế bào.
FACS là một công cụ mạnh mẽ và linh hoạt cho phép phân tích và phân loại tế bào dựa trên nhiều đặc điểm. Nó đóng vai trò quan trọng trong nhiều lĩnh vực nghiên cứu và ứng dụng y sinh, từ nghiên cứu cơ bản đến chẩn đoán và điều trị bệnh.
Phân loại tế bào kích hoạt bằng huỳnh quang (FACS) là một kỹ thuật mạnh mẽ cho phép phân tích và phân loại tế bào dựa trên các đặc điểm vật lý và hóa học. Nguyên lý cốt lõi của kỹ thuật này là sử dụng các kháng thể huỳnh quang để đánh dấu các tế bào, sau đó phân tích và phân loại chúng dựa trên cường độ huỳnh quang phát ra khi đi qua tia laser. Việc lựa chọn fluorophores phù hợp, cân nhắc bước sóng kích thích và phát xạ, độ sáng và khả năng tương thích, là rất quan trọng để tối ưu hóa kết quả.
Quá trình FACS bao gồm các bước chính: đánh dấu tế bào, đưa mẫu vào dòng chảy, chiếu tia laser, đo lường tín hiệu và phân tích/phân loại. Hydrodynamic focusing tạo ra một dòng tế bào đơn lẻ, đảm bảo mỗi tế bào đi qua tia laser một cách riêng lẻ. Ánh sáng tán xạ phía trước (FSC) cung cấp thông tin về kích thước tế bào ($FSC propto kích thước$), trong khi ánh sáng tán xạ bên (SSC) cho biết độ hạt của tế bào ($SSC propto độ$ $hạt$).
Phân tích dữ liệu thu được từ các PMT cho phép xác định các quần thể tế bào khác nhau. Trong quá trình phân loại, dòng tế bào được chia thành các giọt, và các giọt chứa tế bào mong muốn được tích điện và làm lệch hướng bởi điện trường vào các ống thu thập. Hiệu chỉnh điện áp lệch hướng là cần thiết để đạt được độ tinh khiết cao cho các quần thể tế bào được phân loại.
Chất lượng mẫu đóng vai trò quan trọng trong việc đảm bảo kết quả chính xác. Mẫu cần được chuẩn bị kỹ lưỡng để tránh sự kết tụ và các mảnh vụn tế bào, điều này có thể ảnh hưởng đến việc phân tích và phân loại. Thiết lập máy FACS đúng cách, bao gồm hiệu chỉnh và tối ưu hóa các thông số, cũng rất quan trọng để đạt được kết quả đáng tin cậy. Cuối cùng, FACS là một công cụ vô giá trong nhiều lĩnh vực nghiên cứu, từ miễn dịch học và ung thư học đến sinh học tế bào và kỹ thuật di truyền.
Tài liệu tham khảo:
- Shapiro, Howard M. (2003). Practical Flow Cytometry. John Wiley & Sons.
- Givan, Alice L. (2011). Flow Cytometry: First Principles. Wiley-Blackwell.
- Ormerod, M. G. (Ed.). (2000). Flow Cytometry: A Practical Approach. Oxford University Press.
Câu hỏi và Giải đáp
Ngoài kháng thể, còn những loại chất đánh dấu huỳnh quang nào khác có thể được sử dụng trong FACS?
Trả lời: Ngoài kháng thể, các chất đánh dấu huỳnh quang khác bao gồm protein huỳnh quang (như GFP – Green Fluorescent Protein), thuốc nhuộm liên kết DNA (như propidium iodide cho tế bào chết, Hoechst cho DNA tổng số), và các probe đặc hiệu cho các cấu trúc tế bào hoặc hoạt động enzyme.
Làm thế nào để giảm thiểu sự chồng chéo quang phổ (spectral overlap) giữa các fluorophores khác nhau khi sử dụng nhiều chất đánh dấu trong FACS?
Trả lời: Có một số cách để giảm thiểu sự chồng chéo quang phổ:
- Lựa chọn fluorophores: Chọn các fluorophores có bước sóng kích thích và phát xạ cách xa nhau.
- Bù trừ (Compensation): Điều chỉnh tín hiệu của mỗi kênh detector để loại bỏ tín hiệu từ các fluorophores khác. Đây là một bước quan trọng trong phân tích dữ liệu FACS.
- Sử dụng các panel kháng thể được thiết kế sẵn: Các panel này được tối ưu hóa để giảm thiểu sự chồng chéo quang phổ.
Tín hiệu forward scatter (FSC) và side scatter (SSC) cung cấp thông tin gì về tế bào? Chúng được đo như thế nào?
Trả lời: FSC cung cấp thông tin về kích thước tế bào ($FSC propto kích thước$), trong khi SSC cung cấp thông tin về độ hạt hoặc độ phức tạp bên trong tế bào ($SSC propto độ$ $hạt$). Cả FSC và SSC được đo bằng cách phát hiện ánh sáng laser tán xạ bởi tế bào. FSC được đo ở góc nhỏ so với tia laser, còn SSC được đo ở góc 90 độ.
Kỹ thuật “index sorting” trong FACS là gì và nó có lợi ích gì?
Trả lời: Index sorting là một kỹ thuật ghi lại chính xác vị trí của từng tế bào trong quá trình phân loại. Thông tin này, bao gồm thời gian phân loại và thông tin về giọt chứa tế bào, được lưu trữ cùng với dữ liệu huỳnh quang của tế bào đó. Lợi ích của index sorting là cho phép truy xuất lại thông tin của từng tế bào sau khi phân loại, giúp liên kết dữ liệu FACS với các phân tích downstream như sequencing đơn bào hoặc phân tích biểu hiện gen.
Hạn chế chính của việc sử dụng FACS trong nghiên cứu tế bào là gì?
Trả lời: Một số hạn chế của FACS bao gồm:
- Chi phí: Máy móc và vận hành FACS khá tốn kém.
- Mất thông tin không gian: FACS phân tích tế bào ở dạng huyền phù, do đó mất đi thông tin về vị trí và tương tác của tế bào trong mô.
- Stress cho tế bào: Quá trình phân loại có thể gây stress cho tế bào, ảnh hưởng đến chức năng và khả năng sống sót của chúng.
- Đòi hỏi kỹ thuật chuyên môn: Vận hành và phân tích dữ liệu FACS đòi hỏi kỹ thuật viên có kinh nghiệm.
- Sự ra đời của FACS: Mặc dù cytometry dòng chảy đã xuất hiện từ những năm 1950, máy FACS đầu tiên, có khả năng phân loại tế bào, được phát triển vào cuối những năm 1960 bởi Len Herzenberg, Mack Fulwyler, Richard Sweet và Leonard Herzenberg tại Đại học Stanford. Ban đầu, nó sử dụng một tia laser Argon.
- Tốc độ phân loại đáng kinh ngạc: Các máy FACS hiện đại có thể phân loại hàng ngàn tế bào mỗi giây, với độ chính xác cao. Một số hệ thống thậm chí có thể phân loại lên đến 70,000 tế bào mỗi giây!
- Từ những giọt nước nhỏ bé: Việc phân loại tế bào trong FACS dựa trên việc tạo ra các giọt nước cực nhỏ, mỗi giọt chứa một tế bào duy nhất. Kích thước của những giọt này chỉ vào khoảng vài micromet.
- Ứng dụng trong khám phá thuốc: FACS đóng vai trò quan trọng trong việc phát triển thuốc mới, đặc biệt là trong lĩnh vực immunotherapy. Nó cho phép các nhà nghiên cứu xác định và phân lập các tế bào miễn dịch cụ thể, giúp phát triển các liệu pháp nhắm mục tiêu chính xác hơn.
- Không chỉ là tế bào: Mặc dù FACS thường được sử dụng để phân loại tế bào, kỹ thuật này cũng có thể được sử dụng để phân loại các hạt khác, chẳng hạn như vi khuẩn, virus, và thậm chí cả nhiễm sắc thể.
- Màu sắc của khoa học: Sự đa dạng của fluorophores (chất huỳnh quang) được sử dụng trong FACS tạo nên một bức tranh đầy màu sắc trong nghiên cứu khoa học. Việc kết hợp nhiều fluorophores cho phép phân tích đồng thời nhiều đặc điểm của tế bào, mang lại cái nhìn toàn diện hơn về hệ thống sinh học.
- “Nghệ thuật” của gating: Phân tích dữ liệu FACS liên quan đến một quá trình gọi là “gating”, trong đó các nhà nghiên cứu xác định các quần thể tế bào quan tâm dựa trên các thông số khác nhau. Quá trình này đòi hỏi kinh nghiệm và kỹ năng, và đôi khi được coi như một “nghệ thuật”.
- Tiến bộ không ngừng: Công nghệ FACS đang liên tục được cải tiến, với sự phát triển của các laser mới, fluorophores sáng hơn và các phần mềm phân tích dữ liệu mạnh mẽ hơn, mở ra những khả năng mới cho nghiên cứu sinh học.