Phân tích tế bào bằng dòng chảy (Flow cytometry)

Nguyên lý hoạt động

Quá trình phân tích tế bào bằng dòng chảy bao gồm các bước sau:

• Chuẩn bị mẫu: Tế bào được nhuộm bằng các kháng thể hoặc thuốc nhuộm huỳnh quang đặc hiệu với các thành phần tế bào quan tâm (ví dụ: protein bề mặt, DNA, RNA). Việc lựa chọn thuốc nhuộm phù hợp rất quan trọng để đảm bảo tín hiệu huỳnh quang rõ ràng và đặc hiệu cho từng loại tế bào hay thành phần cần phân tích.
• Dòng chảy tế bào đơn lẻ: Mẫu tế bào được đưa vào dòng chất lỏng (thường là dung dịch đệm) và đi qua một kênh hẹp. Thiết kế của kênh đảm bảo rằng các tế bào di chuyển theo một hàng duy nhất, tạo ra một “dòng chảy tế bào đơn lẻ”. Điều này giúp cho việc chiếu tia laser và thu thập tín hiệu từ từng tế bào được chính xác. Hệ thống thủy động học tập trung dòng tế bào giúp laser có thể chiếu vào từng tế bào một cách riêng rẽ.
• Chiếu sáng bằng laser: Khi các tế bào đi qua chùm tia laser, ánh sáng bị tán xạ và huỳnh quang được phát ra. Bước sóng của laser được lựa chọn dựa trên thuốc nhuộm huỳnh quang được sử dụng.
• Thu thập dữ liệu: Các tín hiệu tán xạ và huỳnh quang được thu thập bởi các detector. Hệ thống detector gồm nhiều kênh khác nhau, mỗi kênh thu nhận một bước sóng huỳnh quang hoặc tín hiệu tán xạ cụ thể. Dữ liệu được chuyển đổi thành tín hiệu điện tử để xử lý. Các thông số thu thập được bao gồm:
  • Tán xạ ánh sáng phía trước (Forward Scatter – FSC): Cường độ tán xạ phía trước tỉ lệ thuận với kích thước tế bào.
  • Tán xạ ánh sáng bên (Side Scatter – SSC): Cường độ tán xạ bên cung cấp thông tin về độ hạt/độ phức tạp bên trong tế bào (ví dụ: hạt nhân, hạt). Thông số này phản ánh cấu trúc bên trong tế bào.
  • Huỳnh quang: Cường độ huỳnh quang cho biết lượng chất nhuộm huỳnh quang gắn vào tế bào, phản ánh sự biểu hiện của phân tử đích.
• Phân tích dữ liệu: Dữ liệu được phân tích bằng phần mềm chuyên dụng. Dữ liệu thường được hiển thị dưới dạng histogram, dot plot, hoặc density plot để phân tích các quần thể tế bào khác nhau dựa trên các thông số đo được. Phần mềm cho phép phân tích, so sánh và trực quan hóa dữ liệu đa chiều.

Ứng dụng

Phân tích tế bào bằng dòng chảy được sử dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực nghiên cứu và ứng dụng lâm sàng, bao gồm:

• Miễn dịch học: Xác định và định lượng các quần thể tế bào miễn dịch khác nhau (ví dụ: lymphocytes T, lymphocytes B, monocytes, tế bào NK). Flow cytometry cho phép phân tích các marker bề mặt đặc trưng của từng loại tế bào miễn dịch, giúp đánh giá hệ miễn dịch và theo dõi đáp ứng miễn dịch.
• Ung thư học: Phát hiện và theo dõi các tế bào ung thư, phân tích chu kỳ tế bào, và đánh giá hiệu quả điều trị. Việc xác định các marker đặc trưng của tế bào ung thư giúp chẩn đoán và tiên lượng bệnh. Phân tích chu kỳ tế bào giúp đánh giá tốc độ phát triển của khối u.
• Huyết học: Đếm tế bào máu, chẩn đoán các bệnh về máu như leukemia và lymphoma. Flow cytometry cho phép phân tích nhanh chóng và chính xác các thành phần tế bào máu.
• Vi sinh vật học: Phân tích vi khuẩn, nấm men, và các vi sinh vật khác. Kỹ thuật này có thể được sử dụng để xác định và định lượng các loại vi sinh vật khác nhau trong mẫu.
• Kỹ thuật di truyền: Phân loại tế bào dựa trên sự biểu hiện của protein huỳnh quang, ví dụ như protein huỳnh quang xanh (GFP). Kỹ thuật này cho phép phân lập các tế bào có biểu hiện gen mong muốn.

Ưu điểm

• Phân tích nhanh chóng một lượng lớn tế bào: Flow cytometry có thể phân tích hàng ngàn tế bào mỗi giây, cung cấp dữ liệu thống kê đáng tin cậy.
• Phân tích đồng thời nhiều thông số trên từng tế bào riêng lẻ: Cho phép phân tích đa chiều và xác định các quần thể tế bào phức tạp.
• Định lượng chính xác các quần thể tế bào: Cung cấp dữ liệu định lượng về tỷ lệ phần trăm của các loại tế bào khác nhau trong mẫu.
• Có thể phân loại tế bào (cell sorting): Cho phép phân lập các quần thể tế bào cụ thể để nghiên cứu sâu hơn.

Nhược điểm

• Cần thiết bị chuyên dụng và đắt tiền: Chi phí đầu tư và vận hành máy flow cytometry khá cao.
• Cần chuẩn bị mẫu cẩn thận: Quá trình chuẩn bị mẫu cần được thực hiện cẩn thận để tránh gây nhiễu tín hiệu và ảnh hưởng đến kết quả.
• Thông tin về hình thái tế bào bị hạn chế: Flow cytometry chủ yếu cung cấp thông tin về kích thước, độ hạt và các marker bề mặt, nhưng không cung cấp hình ảnh chi tiết về hình thái tế bào. Thông thường, kỹ thuật này được kết hợp với kính hiển vi để có cái nhìn tổng quan hơn.

Ví dụ về phân tích dữ liệu

Một dot plot hiển thị dữ liệu SSC (trục y) so với FSC (trục x) có thể được sử dụng để phân biệt các loại tế bào khác nhau dựa trên kích thước và độ hạt. Ví dụ: lymphocytes thường nhỏ và ít hạt hơn so với monocytes. Ngoài dot plot, histogram cũng thường được sử dụng để hiển thị sự phân bố của một thông số cụ thể, ví dụ như cường độ huỳnh quang.

Công thức cơ bản (đơn giản hóa) cho số lượng tế bào trong một quần thể cụ thể:

Số lượng tế bào = Tổng số tế bào đếm được x (% tế bào trong quần thể quan tâm) / 100

Phân loại tế bào (Cell Sorting)

Một ứng dụng quan trọng của flow cytometry là khả năng phân loại vật lý các tế bào dựa trên các đặc điểm cụ thể. Máy phân loại tế bào (cell sorter) sử dụng nguyên tắc điện tích để tách các tế bào quan tâm khỏi quần thể tế bào hỗn hợp. Sau khi các tế bào đi qua laser và được phân tích, dòng chất lỏng chứa các tế bào được chia thành các giọt nhỏ. Dựa trên các thông số được thiết lập trước, các giọt chứa tế bào quan tâm được tích điện dương hoặc âm. Các giọt tích điện sau đó đi qua một điện trường và bị lệch hướng vào các ống thu khác nhau, cho phép thu thập các quần thể tế bào tinh khiết. Kỹ thuật này rất hữu ích cho việc phân lập các tế bào đặc biệt để nuôi cấy hoặc nghiên cứu sâu hơn.

Các loại thuốc nhuộm và kháng thể huỳnh quang

Sự thành công của flow cytometry phụ thuộc rất nhiều vào việc sử dụng các thuốc nhuộm và kháng thể huỳnh quang phù hợp. Một loạt các thuốc nhuộm và kháng thể có sẵn cho phép phân tích nhiều thông số tế bào khác nhau. Ví dụ:

• Thuốc nhuộm liên kết DNA: Propidium iodide (PI), 7-Aminoactinomycin D (7-AAD) được sử dụng để phân tích chu kỳ tế bào và xác định tế bào chết. Các thuốc nhuộm này chỉ có thể xâm nhập vào tế bào có màng tế bào bị tổn thương.
• Thuốc nhuộm liên kết với các bào quan: MitoTracker, LysoTracker được sử dụng để nhuộm ty thể và lysosome. Các thuốc nhuộm này cho phép phân tích chức năng và hình thái của các bào quan.
• Kháng thể huỳnh quang: Kháng thể được gắn với các chất huỳnh quang như FITC, PE, APC, PerCP, v.v. được sử dụng để phát hiện các protein bề mặt và nội bào. Việc lựa chọn kháng thể phù hợp rất quan trọng để đảm bảo tính đặc hiệu và độ nhạy của phân tích.

Các cân nhắc kỹ thuật

• Bù trừ (Compensation): Sự chồng chéo phổ phát xạ của các chất huỳnh quang khác nhau có thể gây ra nhiễu tín hiệu. Bù trừ là một quá trình hiệu chỉnh được sử dụng để loại bỏ sự chồng chéo này và đảm bảo đo lường chính xác.
• Kiểm soát: Các kiểm soát thích hợp là cần thiết để giải thích chính xác dữ liệu flow cytometry. Các kiểm soát phổ biến bao gồm kiểm soát isotype, kiểm soát chưa nhuộm, và kiểm soát đơn nhuộm.

Những tiến bộ gần đây

• CyTOF (Cytometry by Time-Of-Flight): Sử dụng các kháng thể được gắn với các đồng vị kim loại thay vì chất huỳnh quang, cho phép phân tích đồng thời nhiều thông số hơn (lên đến 40-50). Kỹ thuật này giảm thiểu đáng kể hiện tượng chồng chéo phổ phát xạ.
• Spectral flow cytometry: Phân tích toàn bộ phổ phát xạ của mỗi chất huỳnh quang, cho phép phân biệt tốt hơn giữa các tín hiệu chồng chéo và phân tích nhiều thông số hơn.
• Imaging flow cytometry: Kết hợp flow cytometry với hình ảnh hiển vi, cung cấp thông tin về hình thái tế bào cũng như các đặc điểm huỳnh quang. Kỹ thuật này cung cấp cái nhìn toàn diện hơn về tế bào.

• Shapiro, H. M. (2003). Practical flow cytometry. John Wiley & Sons.
• Ormerod, M. G. (Ed.). (2000). Flow cytometry: a practical approach. Oxford University Press.
• Givan, A. L. (2011). Flow cytometry: first principles. John Wiley & Sons.

Câu hỏi và Giải đáp

Làm thế nào để chọn lựa các chất huỳnh quang phù hợp cho một thí nghiệm flow cytometry?

Trả lời: Việc lựa chọn chất huỳnh quang phụ thuộc vào một số yếu tố, bao gồm:

• Các phân tử đích: Chọn chất huỳnh quang tương thích với các kháng thể hoặc thuốc nhuộm đặc hiệu cho phân tử đích.
• Máy flow cytometry: Xác định các laser và bộ lọc có sẵn trên máy và chọn chất huỳnh quang có thể được kích thích và phát hiện bởi hệ thống.
• Sự chồng chéo phổ: Cân nhắc sự chồng chéo phổ phát xạ của các chất huỳnh quang khác nhau và chọn các chất huỳnh quang có phổ tách biệt hoặc sử dụng kỹ thuật bù trừ.
• Độ sáng: Chọn chất huỳnh quang có độ sáng cao để tăng độ nhạy của phép đo.

Bù trừ (compensation) trong flow cytometry là gì và tại sao nó quan trọng?

Trả lời: Bù trừ là quá trình hiệu chỉnh sự chồng chéo phổ phát xạ của các chất huỳnh quang khác nhau. Khi một chất huỳnh quang được kích thích, nó có thể phát ra ánh sáng ở nhiều bước sóng khác nhau. Sự chồng chéo này có thể dẫn đến việc tín hiệu từ một chất huỳnh quang bị ghi nhận nhầm thành tín hiệu từ một chất huỳnh quang khác. Bù trừ giúp loại bỏ sự chồng chéo này và đảm bảo đo lường chính xác cường độ huỳnh quang của từng chất.

Sự khác biệt giữa histogram và dot plot trong phân tích dữ liệu flow cytometry là gì?

Trả lời: Histogram hiển thị phân bố của một thông số duy nhất (ví dụ: FSC, SSC, huỳnh quang) cho toàn bộ quần thể tế bào. Dot plot hiển thị mối quan hệ giữa hai thông số cho từng tế bào riêng lẻ. Ví dụ, một dot plot hiển thị FSC so với SSC có thể được sử dụng để phân biệt các loại tế bào khác nhau dựa trên kích thước và độ hạt.

CyTOF khác với flow cytometry truyền thống như thế nào?

Trả lời: CyTOF (Cytometry by Time-Of-Flight) sử dụng các kháng thể được gắn với các đồng vị kim loại thay vì chất huỳnh quang. Các ion kim loại được phát hiện bằng khối phổ kế thời gian bay (TOF), cho phép phân tích đồng thời nhiều thông số hơn (lên đến 40-50) so với flow cytometry truyền thống, do sự chồng chéo phổ của các đồng vị kim loại rất nhỏ.

Làm thế nào để chuẩn bị mẫu tế bào cho phân tích flow cytometry?

Trả lời: Chuẩn bị mẫu tế bào cho flow cytometry bao gồm các bước sau:

• Thu thập tế bào: Tế bào có thể được thu thập từ máu, mô, hoặc nuôi cấy tế bào.
• Nhuộm tế bào: Tế bào được nhuộm bằng các kháng thể hoặc thuốc nhuộm huỳnh quang đặc hiệu với các phân tử đích.
• Ly giải hồng cầu (nếu cần): Nếu mẫu chứa hồng cầu, cần ly giải hồng cầu để tránh nhiễu tín hiệu.
• Rửa tế bào: Rửa tế bào để loại bỏ các kháng thể hoặc thuốc nhuộm không liên kết.
• Cố định tế bào (nếu cần): Cố định tế bào để bảo quản các phân tử đích.
• Pha loãng tế bào: Pha loãng tế bào đến nồng độ thích hợp cho phân tích flow cytometry.