Phép phân tích phổ khối (Mass spectrometry (MS))

Nguyên lý hoạt động

Nguyên lý cơ bản của MS bao gồm các bước sau:

1. Ion hóa: Mẫu được đưa vào buồng ion hóa, nơi các phân tử trung hòa được chuyển thành ion mang điện tích. Có nhiều kỹ thuật ion hóa khác nhau, bao gồm ion hóa bằng electron (EI), ion hóa hóa học (CI), ion hóa phun điện tử (ESI), ion hóa MALDI (Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization),… Mỗi kỹ thuật có ưu điểm và nhược điểm riêng, phù hợp với các loại mẫu và mục đích phân tích khác nhau. Ví dụ, EI thường tạo ra nhiều ion mảnh, hữu ích cho việc xác định cấu trúc, trong khi ESI phù hợp hơn cho phân tích các phân tử lớn và dễ bay hơi.
2. Phân tách: Các ion được tạo ra sau đó được phân tách dựa trên tỉ lệ m/z của chúng. Quá trình này thường được thực hiện trong một trường điện từ. Ví dụ, trong một máy phân tích phổ khối tứ cực (quadrupole), các ion được đưa qua một trường điện từ dao động. Chỉ các ion có tỉ lệ m/z cụ thể mới có thể đi qua trường này và đến được đầu dò. Các loại máy phân tích phổ khối khác bao gồm bẫy ion (ion trap), thời gian bay (TOF) và cộng hưởng cyclotron ion biến đổi Fourier (FT-ICR).
3. Phát hiện: Các ion được phân tách sau đó được phát hiện bởi một đầu dò, thường là một bộ nhân điện tử. Tín hiệu từ đầu dò tỉ lệ với số lượng ion có cùng tỉ lệ m/z.
4. Phân tích dữ liệu: Dữ liệu thu được được hiển thị dưới dạng phổ khối, là một đồ thị biểu diễn cường độ tín hiệu (trục y) theo tỉ lệ m/z (trục x). Các đỉnh trong phổ khối tương ứng với các ion khác nhau có trong mẫu. Vị trí của đỉnh cho biết tỉ lệ m/z, và cường độ đỉnh cho biết lượng tương đối của ion đó. Phân tích phổ khối có thể được sử dụng để định lượng và định tính các hợp chất trong mẫu.

Ứng dụng

MS có nhiều ứng dụng quan trọng trong nhiều lĩnh vực khác nhau, bao gồm:

• Hóa học: Xác định cấu trúc phân tử, phân tích hỗn hợp phức tạp, nghiên cứu phản ứng hóa học, xác định công thức phân tử, phân tích đồng phân.
• Sinh học: Xác định protein, peptide, phân tích metabolomic, nghiên cứu tương tác protein-protein, phân tích lipid, xác định carbohydrate.
• Y học: Phát hiện thuốc doping, sàng lọc sơ sinh, chẩn đoán bệnh, phát triển thuốc mới, giám sát điều trị.
• Khoa học môi trường: Phân tích ô nhiễm môi trường, giám sát chất lượng không khí và nước, phân tích thành phần đất.
• Khoa học vật liệu: Phân tích thành phần nguyên tố của vật liệu, xác định cấu trúc polymer, nghiên cứu vật liệu nano.
• Khảo cổ học: Xác định niên đại của các di vật cổ, phân tích thành phần của các hiện vật.

Một số loại máy phổ khối phổ biến

• Máy phổ khối tứ cực (Quadrupole MS): Phổ biến, nhỏ gọn, giá cả phải chăng, thích hợp cho phân tích định lượng, độ nhạy và độ phân giải vừa phải.
• Máy phổ khối bẫy ion (Ion Trap MS): Có khả năng phân tích MS/MS (tandem MS), giúp xác định cấu trúc phân tử phức tạp, độ nhạy cao.
• Máy phổ khối thời gian bay (Time-of-Flight MS – TOF): Độ phân giải cao, thích hợp cho phân tích các phân tử lớn, dải khối lượng rộng. Ngoài ra còn có các loại máy phổ khối khác như FT-ICR (Fourier Transform Ion Cyclotron Resonance) và Orbitrap với độ phân giải và độ chính xác khối lượng rất cao.

Ví dụ về dữ liệu từ MS

Một phổ khối sẽ hiển thị các đỉnh tại các giá trị m/z khác nhau. Ví dụ, một phân tử có khối lượng phân tử là 100 Da và mang một điện tích dương (+1) sẽ xuất hiện một đỉnh tại m/z = 100. Nếu phân tử này mất một electron và mang hai điện tích dương (+2), nó sẽ xuất hiện một đỉnh tại m/z = 50 (100/2). Cường độ của đỉnh tại m/z = 100 và m/z = 50 sẽ phụ thuộc vào hiệu suất ion hóa và sự phân mảnh của phân tử. Phân tích các đỉnh này và các đỉnh mảnh khác (nếu có) giúp xác định cấu trúc của phân tử.

MS là một kỹ thuật mạnh mẽ với nhiều ứng dụng rộng rãi. Sự phát triển liên tục của các kỹ thuật ion hóa và phân tích mới đã giúp MS trở thành một công cụ không thể thiếu trong nhiều lĩnh vực nghiên cứu khoa học.

Phân tích phổ khối Tandem (MS/MS)

Một kỹ thuật quan trọng trong MS là phân tích phổ khối tandem (MS/MS), còn được gọi là MS². Trong MS/MS, các ion được chọn từ phổ MS ban đầu (ion tiền chất – precursor ion) được phân mảnh thêm bằng cách va chạm với khí trư (CID – Collision-Induced Dissociation) hoặc các phương pháp khác như ETD (Electron Transfer Dissociation) và HCD (Higher-energy Collisional Dissociation). Các ion mảnh (ion sản phẩm – product ion) sau đó được phân tích theo tỉ lệ m/z của chúng, tạo ra phổ MS/MS. Phổ MS/MS cung cấp thông tin về cấu trúc của ion tiền chất, giúp xác định các phân tử phức tạp. Kỹ thuật này đặc biệt hữu ích cho việc phân tích peptide và protein.

Độ phân giải

Độ phân giải của máy phổ khối là khả năng phân biệt hai ion có tỉ lệ m/z gần nhau. Độ phân giải cao cho phép xác định chính xác khối lượng của ion và phân biệt các ion có khối lượng rất gần nhau. Độ phân giải thường được định nghĩa là $R = m/\Delta m$, trong đó m là khối lượng của ion và $\Delta m$ là độ rộng của đỉnh ở một độ cao nhất định (ví dụ: độ rộng ở nửa chiều cao cực đại – FWHM – Full Width at Half Maximum). Độ phân giải càng cao thì khả năng phân biệt các ion càng tốt.

Độ chính xác khối lượng

Độ chính xác khối lượng là thước đo mức độ chính xác mà máy phổ khối có thể xác định khối lượng của một ion. Độ chính xác khối lượng cao rất quan trọng trong việc xác định công thức phân tử và phân biệt các ion có khối lượng danh nghĩa giống nhau nhưng thành phần nguyên tố khác nhau. Độ chính xác khối lượng thường được biểu diễn bằng ppm (parts per million).

Các kỹ thuật ion hóa khác

Ngoài EI, CI, ESI và MALDI đã được đề cập ở trên, còn có một số kỹ thuật ion hóa khác được sử dụng trong MS, bao gồm:

• Ion hóa phun điện trường (Field Desorption/Ionization – FD/FI): Thích hợp cho phân tích các phân tử không bay hơi và dễ bị phân hủy nhiệt.
• Ion hóa thứ cấp bằng ion nhanh (Fast Atom Bombardment – FAB): Thích hợp cho phân tích các phân tử phân cực và không bay hơi.
• Phun nhiệt giải hấp (Thermal Desorption/Ionization – TD/TI): Thích hợp cho phân tích các hợp chất hấp phụ trên bề mặt. Một kỹ thuật liên quan là Py-GC-MS, trong đó mẫu được nhiệt phân trước khi được phân tích bằng GC-MS.

Sự kết hợp của MS với các kỹ thuật phân tích khác

MS thường được kết hợp với các kỹ thuật phân tích khác, chẳng hạn như sắc ký khí (GC-MS) và sắc ký lỏng (LC-MS), để phân tích các hỗn hợp phức tạp. Trong GC-MS và LC-MS, các thành phần của hỗn hợp được tách bằng sắc ký trước khi được đưa vào máy phổ khối để phân tích. Sự kết hợp này giúp tăng cường khả năng phân tích của cả hai kỹ thuật. Các kỹ thuật kết hợp khác bao gồm CE-MS (Capillary Electrophoresis-Mass Spectrometry) và ICP-MS (Inductively Coupled Plasma-Mass Spectrometry).

• Mass Spectrometry: Principles and Applications by Edmond de Hoffmann and Vincent Stroobant
• Interpretation of Mass Spectra by Fred W. McLafferty and Frantisek Turecek
• Principles of Instrumental Analysis by Douglas A. Skoog, F. James Holler, and Stanley R. Crouch

Câu hỏi và Giải đáp

Làm thế nào để chọn kỹ thuật ion hóa phù hợp cho một loại mẫu cụ thể?

Trả lời: Việc lựa chọn kỹ thuật ion hóa phụ thuộc vào nhiều yếu tố, bao gồm bản chất của mẫu (ví dụ: phân cực, không phân cực, dễ bay hơi, không bay hơi), khối lượng phân tử, và thông tin cần thu thập. Ví dụ, ESI phù hợp cho các phân tử lớn và phân cực, trong khi EI thích hợp cho các phân tử nhỏ dễ bay hơi. MALDI thường được sử dụng cho phân tích các phân tử sinh học lớn như protein và peptide. CI thường được sử dụng khi cần phổ khối đơn giản hơn so với EI.

Ngoài CID, còn có những phương pháp phân mảnh nào khác được sử dụng trong MS/MS?

Trả lời: Ngoài CID (va chạm với khí trơ), còn có các phương pháp phân mảnh khác như: ETD (Electron Transfer Dissociation), ECD (Electron Capture Dissociation), và HCD (Higher-energy Collisional Dissociation). ETD và ECD đặc biệt hữu ích cho phân tích peptide và protein, trong khi HCD tạo ra phổ mảnh phong phú hơn so với CID.

Độ phân giải và độ chính xác khối lượng ảnh hưởng như thế nào đến việc xác định công thức phân tử?

Trả lời: Độ phân giải cao cho phép phân biệt các ion có m/z rất gần nhau, giúp xác định chính xác khối lượng của ion. Độ chính xác khối lượng cao cho phép xác định chính xác thành phần nguyên tố của ion, từ đó xác định công thức phân tử. Ví dụ, nếu độ chính xác khối lượng đủ cao, ta có thể phân biệt $C_2H_4$ (28.0313 Da) và $N_2$ (28.0061 Da), mặc dù cả hai đều có khối lượng danh nghĩa là 28.

Ưu điểm của việc kết hợp MS với sắc ký (như GC-MS và LC-MS) là gì?

Trả lời: Việc kết hợp MS với sắc ký cho phép tách các thành phần của hỗn hợp phức tạp trước khi được đưa vào máy phổ khối. Điều này giúp giảm thiểu hiện tượng chồng chéo đỉnh trong phổ khối, tăng cường khả năng phân tích định tính và định lượng các thành phần riêng lẻ trong hỗn hợp.

MS có thể được sử dụng để nghiên cứu những loại tương tác phân tử nào?

Trả lời: MS có thể được sử dụng để nghiên cứu nhiều loại tương tác phân tử, bao gồm tương tác protein-protein, tương tác protein-ligand, và tương tác DNA-protein. Ví dụ, kỹ thuật native MS cho phép phân tích các phức hợp protein trong trạng thái tự nhiên của chúng, cung cấp thông tin về khối lượng phân tử và stoichiometry của phức hợp.