Phổ khối ghép nối (Tandem mass spectrometry/MS/MS)

Nguyên lý hoạt động

MS/MS hoạt động dựa trên nguyên lý chọn lọc các ion tiền thân (precursor ions) từ một hỗn hợp phức tạp, phân mảnh chúng và sau đó phân tích các ion mảnh (fragment ions) được tạo ra. Quá trình này diễn ra theo các bước sau:

1. Ion hóa: Mẫu được ion hóa bằng một trong nhiều kỹ thuật ion hóa, ví dụ như ion hóa điện tử (EI), ion hóa hóa học (CI), ion hóa phun điện tử (ESI), hoặc ion hóa khử hấp phụ laser hỗ trợ nền (MALDI). Kết quả là tạo ra một hỗn hợp các ion với khối lượng/điện tích (m/z) khác nhau.
2. Lựa chọn ion tiền thân: Một ion cụ thể với m/z mong muốn (ion tiền thân) được chọn lọc từ hỗn hợp ion ban đầu bằng bộ phân tích khối lượng đầu tiên (MS1).
3. Phân mảnh: Ion tiền thân được chọn lọc sau đó bị phân mảnh bằng nhiều phương pháp khác nhau, chẳng hạn như va chạm gây phân mảnh (CID), phân mảnh do electron bắt giữ (ECD), phân mảnh do electron chuyển (ETD), hoặc phân hủy sau nguồn (PSD). Quá trình này tạo ra một tập hợp các ion mảnh, mang thông tin về cấu trúc của ion tiền thân.
4. Phân tích ion mảnh: Các ion mảnh được tạo ra sau đó được phân tích bằng bộ phân tích khối lượng thứ hai (MS2). Phổ khối lượng thu được cho thấy m/z của các ion mảnh, cung cấp thông tin về cấu trúc của ion tiền thân.

Các loại máy MS/MS

Có nhiều loại máy MS/MS khác nhau, mỗi loại sử dụng các bộ phân tích khối lượng khác nhau để đạt được sự phân tách và phân mảnh ion. Một số loại phổ biến bao gồm:

• Bộ phân tích khối lượng tứ cực ba lần (Triple Quadrupole): Sử dụng ba tứ cực, trong đó Q1 chọn ion tiền thân, q2 là buồng va chạm (thường chứa khí trơ như Argon hoặc Nitơ), và Q3 phân tích các ion mảnh. Loại máy này phổ biến nhờ độ nhạy và khả năng định lượng tốt.
• Bẫy ion (Ion Trap): Giữ và phân mảnh các ion trong một trường điện từ. Bẫy ion có thể thực hiện nhiều giai đoạn phân mảnh (MSⁿ), cung cấp thông tin cấu trúc chi tiết hơn.
• Thời gian bay (Time-of-Flight – TOF/TOF): Đo thời gian các ion bay qua một khoảng cách nhất định để xác định m/z. TOF/TOF cung cấp độ phân giải khối lượng cao và tốc độ quét nhanh.
• Cộng hưởng cyclotron ion biến đổi Fourier (FT-ICR): Đo tần số cyclotron của các ion trong từ trường. FT-ICR cung cấp độ phân giải và độ chính xác khối lượng cao nhất trong tất cả các loại máy MS.
• Orbitrap: Bẫy ion trong một trường tĩnh điện. Orbitrap cũng cung cấp độ phân giải và độ chính xác khối lượng cao, tương tự như FT-ICR.

Ứng dụng

MS/MS có nhiều ứng dụng trong các lĩnh vực khác nhau, bao gồm:

• Xác định protein và peptide: Xác định trình tự amino acid và sửa đổi sau dịch mã. Ứng dụng này rất quan trọng trong proteomics.
• Phân tích thuốc và chất chuyển hóa: Xác định và định lượng thuốc và chất chuyển hóa của chúng trong các mẫu sinh học. Điều này rất hữu ích trong dược động học và dược lực học.
• Phân tích môi trường: Xác định và định lượng các chất ô nhiễm trong môi trường.
• Phân tích thực phẩm: Xác định thành phần và chất gây ô nhiễm trong thực phẩm. Việc này giúp kiểm soát chất lượng và an toàn thực phẩm.
• Phân tích lipidomics: Nghiên cứu lipid, thành phần và chức năng của chúng trong các hệ thống sinh học.

Ưu điểm của MS/MS

Độ nhạy cao: Cho phép phát hiện các phân tử ở nồng độ rất thấp.

Độ chọn lọc cao: Cho phép phân tích có chọn lọc các ion mong muốn, giảm nhiễu nền và tăng độ chính xác.

Cung cấp thông tin cấu trúc: Giúp xác định cấu trúc của các phân tử phức tạp thông qua việc phân tích các ion mảnh.

MS/MS là một kỹ thuật phân tích mạnh mẽ với nhiều ứng dụng trong nhiều lĩnh vực khác nhau. Khả năng chọn lọc và phân mảnh các ion cụ thể cung cấp thông tin cấu trúc có giá trị, làm cho MS/MS trở thành một công cụ thiết yếu cho nghiên cứu và phân tích.

Các phương pháp phân mảnh

Như đã đề cập, có một số phương pháp phân mảnh khác nhau được sử dụng trong MS/MS. Mỗi phương pháp sử dụng một cơ chế khác nhau để phân mảnh ion tiền thân, dẫn đến các kiểu phân mảnh đặc trưng. Một số phương pháp phổ biến bao gồm:

• Va chạm gây phân mảnh (CID): Ion tiền thân được gia tốc và va chạm với một khí trơ (như helium, argon hoặc nitrogen). Năng lượng động năng được chuyển đổi thành năng lượng nội tại, gây ra sự phân mảnh của ion tiền thân. CID thường tạo ra các ion mảnh b và y, hữu ích cho việc xác định trình tự peptide.
• Phân mảnh do electron bắt giữ (ECD): Ion tiền thân bắt giữ một electron năng lượng thấp, dẫn đến sự phân mảnh. ECD đặc biệt hữu ích cho việc phân tích các peptide và protein đã được sửa đổi sau dịch mã, vì nó bảo toàn các sửa đổi này trong quá trình phân mảnh.
• Phân mảnh do electron chuyển (ETD): Tương tự như ECD, nhưng sử dụng một anion gốc để chuyển electron sang ion tiền thân. ETD cũng hữu ích cho việc phân tích các peptide và protein đã được sửa đổi sau dịch mã, đặc biệt là các sửa đổi labile như phosphoryl hóa.
• Phân hủy sau nguồn (PSD): Ion tiền thân bị phân mảnh sau khi rời khỏi nguồn ion hóa, thường do năng lượng nội tại dư thừa. PSD thường được sử dụng với MALDI.

Phân tích dữ liệu

Dữ liệu MS/MS thường được biểu diễn dưới dạng phổ, trong đó cường độ tín hiệu được vẽ theo tỉ lệ khối lượng/điện tích (m/z). Việc phân tích phổ MS/MS có thể được thực hiện bằng tay hoặc bằng phần mềm chuyên dụng. Phần mềm này có thể giúp xác định các ion mảnh, so sánh phổ với cơ sở dữ liệu (như Mascot, Sequest, MaxQuant) và xác định cấu trúc của phân tử tiền thân.

Kết hợp với các kỹ thuật phân tách

MS/MS thường được kết hợp với các kỹ thuật phân tách như sắc ký lỏng (LC) hoặc sắc ký khí (GC) để phân tích các hỗn hợp phức tạp. Sự kết hợp này, được gọi là LC-MS/MS hoặc GC-MS/MS, cho phép phân tách và phân tích các thành phần riêng lẻ trong hỗn hợp trước khi phân tích MS/MS, giúp giảm độ phức tạp của mẫu và tăng độ nhạy của phép đo.

Những thách thức và hạn chế

Mặc dù MS/MS là một kỹ thuật mạnh mẽ, nhưng nó cũng có một số hạn chế:

• Độ phức tạp của dữ liệu: Việc phân tích dữ liệu MS/MS có thể phức tạp, đặc biệt là đối với các phân tử lớn và hỗn hợp phức tạp.
• Yêu cầu thiết bị đắt tiền: Máy MS/MS có giá thành cao và yêu cầu bảo trì thường xuyên.
• Giới hạn về loại phân tử: Không phải tất cả các phân tử đều phù hợp để phân tích bằng MS/MS. Phân tử cần có khả năng ion hóa và phân mảnh trong các điều kiện của máy MS. Một số phân tử có thể quá labile hoặc khó ion hóa.

• Hoffmann, Edmond de; Stroobant, Vincent (2007). Mass Spectrometry: Principles and Applications (3rd ed.). John Wiley & Sons.
• Dass, Chhabil (2007). Fundamentals of Contemporary Mass Spectrometry. John Wiley & Sons.
• Herbert, C. G.; Johnstone, R. A. W. (2003). Mass Spectrometry Basics. CRC Press.

Câu hỏi và Giải đáp

Ngoài CID, ECD, ETD và PSD, còn những phương pháp phân mảnh nào khác được sử dụng trong MS/MS? Ưu điểm và nhược điểm của chúng là gì?

Trả lời: Một số phương pháp phân mảnh khác bao gồm phân mảnh kích hoạt bề mặt (SID), phân mảnh đa photon hồng ngoại (IRMPD), và phân mảnh bức xạ tử ngoại (UVPD). SID sử dụng bề mặt để kích hoạt phân mảnh, IRMPD sử dụng laser hồng ngoại, và UVPD sử dụng laser tử ngoại. Mỗi phương pháp có những ưu điểm và nhược điểm riêng về hiệu quả phân mảnh, loại ion được tạo ra và khả năng tương thích với các loại phân tử khác nhau. Ví dụ, IRMPD phù hợp với các phân tử lớn, trong khi UVPD có thể tạo ra các ion mảnh độc đáo.

Làm thế nào để lựa chọn phương pháp phân mảnh phù hợp cho một ứng dụng cụ thể trong MS/MS?

Trả lời: Việc lựa chọn phương pháp phân mảnh phụ thuộc vào một số yếu tố, bao gồm loại phân tử được phân tích, thông tin cấu trúc mong muốn và loại thiết bị MS/MS có sẵn. Ví dụ, ECD và ETD thường được ưu tiên cho việc phân tích các peptide và protein đã được sửa đổi sau dịch mã, trong khi CID phù hợp hơn cho các phân tử nhỏ hơn.

Phân tích định lượng bằng MS/MS được thực hiện như thế nào? Độ chính xác và độ tin cậy của phương pháp này ra sao?

Trả lời: Phân tích định lượng bằng MS/MS thường sử dụng phương pháp đường chuẩn hoặc phương pháp tỷ lệ đồng vị. Đường chuẩn được xây dựng bằng cách phân tích các dung dịch chuẩn với nồng độ đã biết, trong khi phương pháp tỷ lệ đồng vị sử dụng các hợp chất được đánh dấu đồng vị. Độ chính xác và độ tin cậy của phân tích định lượng bằng MS/MS phụ thuộc vào nhiều yếu tố, bao gồm việc chuẩn bị mẫu, lựa chọn ion chuyển tiếp và điều kiện phân tích.

Vai trò của tin sinh học trong phân tích dữ liệu MS/MS là gì?

Trả lời: Tin sinh học đóng vai trò quan trọng trong việc phân tích dữ liệu MS/MS, đặc biệt là trong proteomics. Các công cụ tin sinh học được sử dụng để xác định peptide và protein từ phổ MS/MS, định lượng protein, phân tích sửa đổi sau dịch mã và xây dựng các mạng lưới tương tác protein.

Những tiến bộ công nghệ gần đây nào đã cải thiện hiệu suất và ứng dụng của MS/MS?

Trả lời: Một số tiến bộ công nghệ gần đây bao gồm sự phát triển của các bộ phân tích khối lượng có độ phân giải và độ nhạy cao hơn, các kỹ thuật ion hóa mới và các phương pháp phân mảnh cải tiến. Những tiến bộ này đã mở rộng ứng dụng của MS/MS trong nhiều lĩnh vực, bao gồm proteomics, metabolomics, và phân tích dược phẩm. Ví dụ, Orbitrap và FT-ICR MS cung cấp độ phân giải khối lượng rất cao, cho phép xác định chính xác hơn các phân tử phức tạp.