Phổ tử ngoại khả kiến (UV-Vis spectroscopy/ Ultraviolet-visible spectroscopy)

Nguyên lý hoạt động

Khi ánh sáng UV-Vis chiếu vào mẫu, các electron trong phân tử có thể hấp thụ năng lượng từ photon và chuyển lên mức năng lượng cao hơn. Năng lượng của photon được hấp thụ phải bằng đúng hiệu năng lượng giữa hai mức năng lượng của electron. Sự hấp thụ này được thể hiện qua sự giảm cường độ của chùm sáng truyền qua mẫu. Quá trình hấp thụ năng lượng này liên quan đến sự chuyển đổi electron giữa các orbital phân tử, chủ yếu là từ orbital liên kết (ví dụ: orbital pi hoặc orbital không liên kết n) lên các orbital phản liên kết (ví dụ: pi hoặc sigma). Các chất khác nhau sẽ hấp thụ ánh sáng ở các bước sóng khác nhau do sự khác biệt về cấu trúc electron và do đó, phổ UV-Vis có thể được sử dụng để xác định các chất.

Công thức liên hệ giữa năng lượng, tần số và bước sóng của photon được biểu diễn như sau:

$E = h\nu = \frac{hc}{\lambda}$

Trong đó:

• $E$: năng lượng của photon (J)
• $h$: hằng số Planck (6.626 x 10^-34 J.s)
• $\nu$: tần số của ánh sáng (Hz)
• $c$: tốc độ ánh sáng (3 x 10⁸ m/s)
• $\lambda$: bước sóng của ánh sáng (m hoặc nm)

Định luật Beer-Lambert

Định luật Beer-Lambert mô tả mối quan hệ giữa độ hấp thụ, nồng độ của chất phân tích và chiều dài đường đi của ánh sáng qua mẫu. Định luật này chỉ áp dụng cho các dung dịch loãng và các chùm sáng đơn sắc. Công thức của định luật Beer-Lambert được biểu diễn như sau:

$A = \epsilon bc$

Trong đó:

• $A$: Độ hấp thụ (absorbance), là một đại lượng không có đơn vị.
• $\epsilon$: Hệ số hấp thụ mol (molar absorptivity), đơn vị là L.mol^-1.cm^-1, thể hiện khả năng hấp thụ ánh sáng của một chất ở một bước sóng cụ thể.
• $b$: Chiều dài đường đi của ánh sáng qua mẫu (cm), thường là chiều dài của cuvet chứa mẫu.
• $c$: Nồng độ của chất phân tích (mol/L).

Ứng dụng

Phổ UV-Vis có nhiều ứng dụng trong các lĩnh vực khác nhau, bao gồm:

• Định lượng: Xác định nồng độ của một chất trong dung dịch bằng cách sử dụng định luật Beer-Lambert.
• Định tính: Xác định các nhóm chức năng hoặc cấu trúc phân tử dựa trên phổ hấp thụ đặc trưng của chúng. Tuy nhiên, phương pháp này thường được sử dụng kết hợp với các phương pháp phân tích khác để xác định chính xác cấu trúc.
• Nghiên cứu động học phản ứng: Theo dõi sự thay đổi nồng độ của chất phản ứng hoặc sản phẩm theo thời gian để xác định tốc độ phản ứng.
• Kiểm tra độ tinh khiết: Phát hiện sự hiện diện của các tạp chất trong mẫu dựa trên sự xuất hiện của các peak (đỉnh) không mong muốn trên phổ.
• Phân tích DNA và protein: Định lượng và đánh giá độ tinh khiết của DNA và protein dựa trên khả năng hấp thụ ánh sáng UV của chúng.
• Ngành công nghiệp thực phẩm: Kiểm tra chất lượng và độ an toàn của thực phẩm.
• Ngành dược phẩm: Kiểm soát chất lượng thuốc và nghiên cứu dược động học.

Thiết bị

Máy quang phổ UV-Vis bao gồm các thành phần chính sau:

• Nguồn sáng: Cung cấp ánh sáng UV-Vis, thường là đèn deuterium (cho vùng UV, 190-350 nm) và đèn tungsten (cho vùng khả kiến, 350-900 nm) hoặc đèn xenon (cho cả vùng UV và khả kiến).
• Bộ đơn sắc: Tách ánh sáng thành các bước sóng riêng lẻ. Bộ đơn sắc thường bao gồm một lăng kính hoặc cách tử nhiễu xạ.
• Buồng mẫu: Chứa mẫu cần phân tích, thường là cuvet thạch anh hoặc thủy tinh quang học.
• Detector (Đầu dò): Đo cường độ ánh sáng truyền qua mẫu. Có nhiều loại detector khác nhau, ví dụ như photomultiplier tube (PMT) hoặc photodiode array.
• Bộ xử lý dữ liệu: Ghi nhận và hiển thị phổ UV-Vis. Dữ liệu thường được hiển thị dưới dạng đồ thị absorbance theo bước sóng.

Ưu điểm của kỹ thuật

UV-Vis spectroscopy sở hữu nhiều ưu điểm khiến nó trở thành một kỹ thuật phổ biến:

• Đơn giản, dễ sử dụng: Quy trình vận hành máy và phân tích dữ liệu tương đối đơn giản, không đòi hỏi kỹ thuật phức tạp.
• Chi phí thấp: Giá thành thiết bị và chi phí vận hành thấp hơn so với nhiều kỹ thuật phân tích khác.
• Thời gian phân tích nhanh: Thời gian đo mẫu thường rất ngắn, chỉ mất vài phút.
• Độ nhạy và độ chính xác cao: Kỹ thuật này có thể phát hiện và định lượng các chất ở nồng độ rất thấp.

Nhược điểm

Mặc dù có nhiều ưu điểm, UV-Vis spectroscopy cũng có một số hạn chế:

• Chỉ áp dụng cho các chất hấp thụ ánh sáng UV-Vis: Các chất không hấp thụ ánh sáng trong vùng UV-Vis sẽ không thể được phân tích bằng kỹ thuật này.
• Có thể bị ảnh hưởng bởi các yếu tố như nhiệt độ, pH và dung môi: Cần kiểm soát các yếu tố này để đảm bảo kết quả chính xác.
• Khó phân tích các mẫu phức tạp có nhiều thành phần hấp thụ chồng chéo: Sự chồng chéo phổ có thể gây khó khăn trong việc định lượng từng thành phần riêng lẻ.

Các yếu tố ảnh hưởng đến phổ UV-Vis

Một số yếu tố có thể ảnh hưởng đến phổ UV-Vis và cần được xem xét khi phân tích:

• pH: Độ pH của dung dịch có thể ảnh hưởng đến trạng thái ion hóa của các phân tử, từ đó ảnh hưởng đến khả năng hấp thụ ánh sáng. Ví dụ, các chất chỉ thị pH đổi màu khi pH thay đổi là do sự thay đổi phổ hấp thụ UV-Vis của chúng.
• Nhiệt độ: Nhiệt độ cao có thể làm tăng động năng của các phân tử, dẫn đến sự mở rộng phổ hấp thụ và giảm độ hấp thụ cực đại.
• Dung môi: Các dung môi khác nhau có thể tương tác với chất phân tích và ảnh hưởng đến phổ hấp thụ. Cần chọn dung môi không hấp thụ ánh sáng trong vùng UV-Vis cần đo và không phản ứng với chất phân tích.
• Nồng độ: Nồng độ của chất phân tích phải nằm trong khoảng tuyến tính của định luật Beer-Lambert để đảm bảo kết quả chính xác. Nồng độ quá cao có thể dẫn đến hiện tượng lệch khỏi định luật Beer-Lambert.
• Tạp chất: Sự hiện diện của các tạp chất hấp thụ ánh sáng ở cùng bước sóng với chất phân tích có thể gây nhiễu và ảnh hưởng đến kết quả đo.

Chuẩn bị mẫu

Việc chuẩn bị mẫu đúng cách là rất quan trọng để đảm bảo kết quả phân tích chính xác. Mẫu cần được hòa tan hoàn toàn trong dung môi phù hợp và lọc để loại bỏ các hạt lơ lửng. Nồng độ của mẫu cần được điều chỉnh sao cho nằm trong khoảng tuyến tính của định luật Beer-Lambert. Cần lưu ý đến các yếu tố ảnh hưởng đến phổ UV-Vis như đã nêu trên khi chuẩn bị mẫu.

Phân tích phổ

Phổ UV-Vis được biểu diễn dưới dạng đồ thị biểu diễn độ hấp thụ (A) theo bước sóng (λ). Các đỉnh hấp thụ trên phổ tương ứng với sự chuyển đổi điện tử trong phân tử. Vị trí và cường độ của các đỉnh hấp thụ có thể được sử dụng để xác định và định lượng chất phân tích. Việc phân tích phổ bao gồm xác định bước sóng hấp thụ cực đại (λ_max) và sử dụng định luật Beer-Lambert để tính nồng độ.

Một số kỹ thuật liên quan

• Phổ huỳnh quang: Kỹ thuật này dựa trên sự phát xạ ánh sáng của phân tử sau khi hấp thụ ánh sáng UV-Vis. Phổ huỳnh quang cung cấp thông tin bổ sung cho phổ UV-Vis, đặc biệt là về cấu trúc và môi trường xung quanh phân tử.
• Phổ tán xạ Raman: Kỹ thuật này dựa trên sự tán xạ ánh sáng bởi phân tử. Phổ Raman cung cấp thông tin về các dao động phân tử, bổ sung cho thông tin về chuyển đổi điện tử từ phổ UV-Vis.

So sánh với các kỹ thuật khác

UV-Vis là một kỹ thuật đơn giản và rẻ hơn so với các kỹ thuật khác như NMR (Cộng hưởng từ hạt nhân) hay khối phổ. Tuy nhiên, UV-Vis có độ đặc hiệu thấp hơn so với các kỹ thuật này. Nó thường được sử dụng như một kỹ thuật sàng lọc ban đầu hoặc kết hợp với các kỹ thuật khác để cung cấp thông tin toàn diện hơn về mẫu.

• Skoog, D. A., Holler, F. J., & Crouch, S. R. (2017). Principles of instrumental analysis. Cengage learning.
• Harris, D. C. (2010). Quantitative chemical analysis. Macmillan.
• Pavia, D. L., Lampman, G. M., Kriz, G. S., & Vyvyan, J. R. (2015). Introduction to spectroscopy. Cengage Learning.

Câu hỏi và Giải đáp

Ngoài định luật Beer-Lambert, còn những yếu tố nào khác có thể ảnh hưởng đến độ hấp thụ (A) trong phổ UV-Vis?

Trả lời: Mặc dù định luật Beer-Lambert là nền tảng cho phân tích định lượng bằng UV-Vis, độ hấp thụ (A) còn bị ảnh hưởng bởi các yếu tố khác như: tán xạ ánh sáng bởi các hạt lơ lửng trong mẫu, huỳnh quang của mẫu, phản xạ ánh sáng tại bề mặt cuvet, sự thay đổi nhiệt độ làm thay đổi hệ số hấp thụ mol ($\epsilon$), và các phản ứng hóa học xảy ra trong mẫu.

Làm thế nào để lựa chọn dung môi phù hợp cho phép đo UV-Vis?

Trả lời: Dung môi lý tưởng cho UV-Vis phải trong suốt trong vùng bước sóng cần đo, không phản ứng với chất phân tích, hòa tan được chất phân tích ở nồng độ mong muốn, và không gây nhiễu cho phép đo. Ví dụ, acetonitrile và methanol thường được sử dụng cho vùng UV, trong khi nước thích hợp cho vùng Vis.

Phổ UV-Vis cung cấp thông tin gì về cấu trúc phân tử?

Trả lời: Phổ UV-Vis chủ yếu cung cấp thông tin về các chuyển đổi điện tử trong phân tử, đặc biệt là chuyển đổi $\pi \rightarrow \pi^$ và $n \rightarrow \pi^$. Vị trí và cường độ của các đỉnh hấp thụ có thể giúp xác định sự hiện diện của các nhóm chức năng nhất định, chẳng hạn như nhóm carbonyl (C=O) hay liên kết đôi (C=C). Tuy nhiên, UV-Vis không cung cấp thông tin chi tiết về cấu trúc như NMR hay khối phổ.

Sự khác biệt giữa phổ hấp thụ và phổ truyền qua là gì?

Trả lời: Cả hai đều biểu diễn sự tương tác của ánh sáng với mẫu, nhưng theo cách khác nhau. Phổ hấp thụ biểu diễn độ hấp thụ (A) theo bước sóng, thể hiện lượng ánh sáng bị mẫu hấp thụ. Phổ truyền qua biểu diễn phần trăm truyền qua (T%) theo bước sóng, thể hiện lượng ánh sáng đi qua mẫu. Chúng có liên quan với nhau theo công thức: $A = -log(T/100)$.

Khi nào cần sử dụng kỹ thuật dò phổ đạo hàm trong UV-Vis?

Trả lời: Kỹ thuật dò phổ đạo hàm, tức là lấy đạo hàm của phổ hấp thụ theo bước sóng, được sử dụng khi cần tăng độ phân giải của phổ, giúp tách các đỉnh hấp thụ chồng lấn. Nó cũng giúp loại bỏ nhiễu nền và nhấn mạnh các đặc điểm nhỏ trên phổ, đặc biệt hữu ích khi phân tích các mẫu phức tạp.