Phương pháp trắc quang (Spectrophotometry/UV-Vis spectrophotometry)

Phương pháp trắc quang là một kỹ thuật phân tích định lượng và định tính dựa trên sự hấp thụ hoặc truyền qua của ánh sáng bởi một dung dịch hoặc chất mẫu. Kỹ thuật này đo lường cường độ ánh sáng truyền qua hoặc hấp thụ ở một bước sóng cụ thể hoặc trong một phạm vi bước sóng nhất định. Trắc quang UV-Vis (Ultraviolet-Visible Spectrophotometry) là một loại trắc quang sử dụng ánh sáng trong vùng tử ngoại (UV) và vùng khả kiến (Vis) của quang phổ điện từ, thường từ 190 nm đến 1100 nm. Việc đo lường sự hấp thụ ánh sáng cho phép xác định nồng độ của chất phân tích trong dung dịch hoặc đánh giá các đặc tính của mẫu dựa trên phổ hấp thụ của nó.

Nguyên lý

Nguyên lý cơ bản của phương pháp trắc quang dựa trên Định luật Beer-Lambert, phát biểu rằng độ hấp thụ của ánh sáng bởi một dung dịch tỉ lệ thuận với nồng độ chất tan và độ dài đường đi của ánh sáng qua dung dịch. Định luật này được biểu diễn bằng công thức:

$A = \epsilon bc$

Trong đó:

$A$: Độ hấp thụ (Absorbance), không có đơn vị. Đại diện cho lượng ánh sáng bị hấp thụ bởi mẫu.
$\epsilon$: Hệ số hấp thụ mol (Molar absorptivity), đơn vị L/(mol.cm). Đại diện cho khả năng hấp thụ ánh sáng của chất tan ở một bước sóng nhất định. Đây là một hằng số đặc trưng cho mỗi chất ở một bước sóng xác định.
$b$: Độ dài đường đi của ánh sáng qua dung dịch (Path length), đơn vị cm. Thường là 1 cm đối với cuvet tiêu chuẩn.
$c$: Nồng độ chất tan (Concentration), đơn vị mol/L.

Cấu tạo của máy trắc quang UV-Vis

Một máy trắc quang UV-Vis điển hình bao gồm các bộ phận chính sau:

Nguồn sáng: Cung cấp ánh sáng đa sắc trong vùng UV-Vis. Thường sử dụng đèn deuterium cho vùng UV (190-350 nm) và đèn tungsten halogen cho vùng Vis (350-1100 nm). Một số máy sử dụng đèn Xenon cung cấp ánh sáng cho cả hai vùng.
Bộ đơn sắc (Monochromator): Chọn lọc bước sóng ánh sáng mong muốn từ nguồn sáng đa sắc. Bộ đơn sắc có thể là lăng kính hoặc cách tử nhiễu xạ. Cách tử nhiễu xạ thường được sử dụng hơn do hiệu suất cao hơn.
Buồng chứa mẫu: Đựng mẫu cần đo, thường là cuvet thạch anh hoặc thủy tinh. Cuvet thạch anh được sử dụng cho vùng UV vì thủy tinh hấp thụ mạnh ánh sáng UV. Độ dài đường đi của cuvet thường là 1 cm.
Detector (Đầu dò): Đo cường độ ánh sáng truyền qua mẫu. Detector chuyển đổi năng lượng ánh sáng thành tín hiệu điện. Có nhiều loại detector khác nhau, ví dụ như photomultiplier tube (PMT) hoặc photodiode array (PDA). PDA cho phép đo đồng thời nhiều bước sóng, giúp rút ngắn thời gian phân tích.
Bộ xử lý tín hiệu và hiển thị: Xử lý tín hiệu điện từ detector và hiển thị kết quả dưới dạng độ hấp thụ hoặc độ truyền qua. Kết quả thường được hiển thị trên màn hình hoặc được in ra.

Ứng dụng

Phương pháp trắc quang UV-Vis có nhiều ứng dụng trong các lĩnh vực khác nhau, bao gồm:

Định lượng: Xác định nồng độ của một chất trong dung dịch bằng cách sử dụng định luật Beer-Lambert. Đây là ứng dụng phổ biến nhất của kỹ thuật này.
Định tính: Xác định các chất dựa trên phổ hấp thụ đặc trưng của chúng. Mỗi chất có một phổ hấp thụ riêng, giống như “dấu vân tay” của chất đó.
Nghiên cứu động học phản ứng: Theo dõi tốc độ phản ứng hóa học bằng cách đo sự thay đổi độ hấp thụ theo thời gian.
Nghiên cứu cấu trúc phân tử: Phân tích phổ hấp thụ để xác định các nhóm chức và cấu trúc của phân tử.
Phân tích dược phẩm: Kiểm tra chất lượng và độ tinh khiết của dược phẩm.
Phân tích môi trường: Xác định nồng độ các chất ô nhiễm trong nước, đất và không khí.

Ưu điểm

Nhanh chóng và dễ sử dụng: Quá trình đo khá đơn giản và nhanh chóng.
Độ chính xác và độ nhạy cao: Kỹ thuật này cho phép đo với độ chính xác và độ nhạy tốt.
Chi phí tương đối thấp: Máy trắc quang UV-Vis có giá thành hợp lý so với các kỹ thuật phân tích khác.

Nhược điểm

Chỉ áp dụng cho các chất hấp thụ ánh sáng trong vùng UV-Vis: Các chất không hấp thụ ánh sáng trong vùng này sẽ không thể phân tích bằng phương pháp này.
Độ chọn lọc có thể bị hạn chế đối với các chất có phổ hấp thụ chồng lấn: Nếu hai hay nhiều chất trong mẫu có phổ hấp thụ chồng lấn lên nhau, việc định lượng riêng lẻ từng chất sẽ gặp khó khăn.
Yêu cầu mẫu đo phải đồng nhất và trong suốt: Mẫu đục hoặc không đồng nhất sẽ gây tán xạ ánh sáng, ảnh hưởng đến kết quả đo.

Độ truyền qua (Transmittance)

Ngoài độ hấp thụ ($A$), ta còn có thể sử dụng độ truyền qua ($T$) để biểu thị lượng ánh sáng truyền qua mẫu. Độ truyền qua là tỉ số giữa cường độ ánh sáng truyền qua mẫu ($I$) và cường độ ánh sáng tới ($I_0$):

$T = \frac{I}{I_0}$

Độ truyền qua thường được biểu diễn dưới dạng phần trăm (%T):

$\%T = \frac{I}{I_0} \times 100$

Mối quan hệ giữa độ hấp thụ và độ truyền qua được thể hiện qua công thức:

$A = -log{10}(T) = 2 – log{10}(\%T)$

Xác định nồng độ bằng phương pháp trắc quang

Để xác định nồng độ của một chất chưa biết, ta cần xây dựng đường chuẩn (calibration curve). Đường chuẩn là đồ thị biểu diễn mối quan hệ giữa độ hấp thụ và nồng độ của một loạt dung dịch chuẩn có nồng độ đã biết. Bằng cách đo độ hấp thụ của mẫu chưa biết và đối chiếu với đường chuẩn, ta có thể xác định nồng độ của chất trong mẫu. Cần lưu ý rằng đường chuẩn chỉ tuyến tính trong một khoảng nồng độ nhất định.

Các yếu tố ảnh hưởng đến kết quả đo

Độ sạch của cuvet: Cuvet bẩn có thể ảnh hưởng đến độ hấp thụ và độ truyền qua của ánh sáng, dẫn đến kết quả sai lệch.
Nhiệt độ: Nhiệt độ có thể ảnh hưởng đến hệ số hấp thụ mol và do đó ảnh hưởng đến kết quả đo. Cần kiểm soát nhiệt độ trong quá trình đo.
pH: pH của dung dịch có thể ảnh hưởng đến cấu trúc của chất tan và do đó ảnh hưởng đến phổ hấp thụ.
Sự hiện diện của các chất gây nhiễu: Các chất khác trong mẫu có thể hấp thụ ánh sáng ở cùng bước sóng với chất cần phân tích, gây ra sai số trong kết quả đo. Cần loại bỏ các chất gây nhiễu trước khi đo.

Các kỹ thuật trắc quang khác

Ngoài trắc quang UV-Vis, còn có các kỹ thuật trắc quang khác như:

Trắc quang hồng ngoại (Infrared Spectroscopy – IR): Sử dụng ánh sáng hồng ngoại để nghiên cứu các dao động phân tử, từ đó xác định các nhóm chức năng trong phân tử.
Trắc quang huỳnh quang (Fluorescence Spectroscopy): Đo cường độ ánh sáng huỳnh quang phát ra bởi mẫu sau khi bị kích thích bởi ánh sáng. Kỹ thuật này rất nhạy và thường được dùng để phân tích các chất có khả năng phát huỳnh quang.
Trắc quang tán xạ Raman (Raman Spectroscopy): Nghiên cứu sự tán xạ Raman của ánh sáng bởi mẫu, cung cấp thông tin về cấu trúc và thành phần hóa học của mẫu.

Tóm tắt về Phương pháp trắc quang

Phương pháp trắc quang, đặc biệt là trắc quang UV-Vis, là một kỹ thuật phân tích mạnh mẽ được sử dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực. Nguyên lý hoạt động dựa trên Định luật Beer-Lambert, $A = \epsilon b c$, mô tả mối quan hệ giữa độ hấp thụ, hệ số hấp thụ mol, độ dài đường đi của ánh sáng và nồng độ chất tan. Việc nắm vững định luật này là chìa khóa để hiểu và áp dụng phương pháp trắc quang một cách hiệu quả.

Khi thực hiện phân tích trắc quang, việc xây dựng đường chuẩn là bước quan trọng để định lượng nồng độ chất chưa biết. Đường chuẩn được tạo bằng cách đo độ hấp thụ của một loạt dung dịch chuẩn có nồng độ đã biết. Từ đó, ta có thể xác định nồng độ của mẫu chưa biết bằng cách đối chiếu độ hấp thụ của nó với đường chuẩn. Cần lưu ý rằng đường chuẩn chỉ có hiệu lực trong một khoảng nồng độ nhất định.

Độ sạch của cuvet, nhiệt độ, pH và sự hiện diện của các chất gây nhiễu là những yếu tố có thể ảnh hưởng đáng kể đến kết quả đo trắc quang. Do đó, cần kiểm soát cẩn thận các yếu tố này để đảm bảo độ chính xác và độ tin cậy của kết quả. Việc lựa chọn bước sóng đo cũng rất quan trọng và nên chọn bước sóng mà chất phân tích hấp thụ mạnh nhất.

Ngoài trắc quang UV-Vis, còn tồn tại nhiều kỹ thuật trắc quang khác như trắc quang hồng ngoại (IR), trắc quang huỳnh quang và trắc quang tán xạ Raman, mỗi kỹ thuật đều có nguyên lý và ứng dụng riêng. Việc lựa chọn kỹ thuật phù hợp phụ thuộc vào mục đích phân tích và tính chất của mẫu. Tìm hiểu về các kỹ thuật này sẽ mở rộng khả năng ứng dụng của phương pháp trắc quang trong nghiên cứu và phân tích.

Tài liệu tham khảo:

Skoog, D. A., Holler, F. J., & Crouch, S. R. (2014). Principles of instrumental analysis. Cengage learning.
Harris, D. C. (2010). Quantitative chemical analysis. Macmillan.
Pavia, D. L., Lampman, G. M., Kriz, G. S., & Vyvyan, J. R. (2015). Introduction to spectroscopy. Cengage Learning.
Silverstein, R. M., Webster, F. X., & Kiemle, D. J. (2014). Spectrometric identification of organic compounds. John wiley & sons.

Câu hỏi và Giải đáp

Tại sao cuvet thạch anh được ưa chuộng hơn cuvet thủy tinh khi đo trong vùng tử ngoại (UV)?

Trả lời: Thủy tinh hấp thụ mạnh ánh sáng UV, làm giảm cường độ ánh sáng đến detector và ảnh hưởng đến kết quả đo. Cuvet thạch anh có độ trong suốt cao trong vùng UV, cho phép ánh sáng UV truyền qua tốt hơn, đảm bảo độ chính xác của phép đo.

Ngoài nồng độ, yếu tố nào khác có thể ảnh hưởng đến giá trị của hệ số hấp thụ mol ($\epsilon$)?

Trả lời: Hệ số hấp thụ mol ($\epsilon$) phụ thuộc vào bản chất của chất tan, bước sóng của ánh sáng và môi trường dung môi. Nhiệt độ và pH cũng có thể ảnh hưởng đến $\epsilon$ bằng cách thay đổi cấu trúc của chất tan.

Làm thế nào để xử lý dữ liệu khi có sự chồng lấn phổ hấp thụ của các chất trong mẫu?

Trả lời: Khi có sự chồng lấn phổ, ta có thể sử dụng các phương pháp phân tích đa biến như phương pháp bình phương tối thiểu một phần (PLS) hoặc phương pháp phân tích thành phần chính (PCA) để tách các tín hiệu chồng lấn và định lượng từng chất riêng biệt.

Độ lệch so với Định luật Beer-Lambert có thể xảy ra trong những trường hợp nào?

Trả lời: Độ lệch có thể xảy ra khi nồng độ chất tan quá cao (tương tác giữa các phân tử chất tan), khi có sự tán xạ ánh sáng bởi các hạt lơ lửng trong dung dịch, hoặc khi sử dụng ánh sáng không đơn sắc. Ngoài ra, các phản ứng hóa học hoặc sự phân ly/kết hợp của chất tan cũng có thể gây ra độ lệch.

Ưu điểm của phương pháp trắc quang so với các phương pháp phân tích khác như sắc ký là gì?

Trả lời: Phương pháp trắc quang thường nhanh hơn, đơn giản hơn và ít tốn kém hơn so với sắc ký. Nó phù hợp cho việc phân tích định lượng các chất có sẵn đường chuẩn và không yêu cầu quá trình tách phức tạp như sắc ký. Tuy nhiên, trắc quang có thể kém chọn lọc hơn sắc ký khi phân tích hỗn hợp phức tạp.

Một số điều thú vị về Phương pháp trắc quang

Màu sắc của thế giới xung quanh: Màu sắc mà chúng ta nhìn thấy là kết quả của sự hấp thụ chọn lọc ánh sáng khả kiến bởi các vật chất. Một quả táo màu đỏ hấp thụ tất cả các màu của quang phổ khả kiến trừ màu đỏ, màu đỏ được phản xạ lại và đến mắt chúng ta. Phương pháp trắc quang UV-Vis khai thác chính nguyên lý này để phân tích các chất.
Tử ngoại “vô hình” nhưng hữu ích: Mặc dù chúng ta không thể nhìn thấy ánh sáng tử ngoại, nhưng nó lại đóng vai trò quan trọng trong trắc quang. Nhiều phân tử hữu cơ hấp thụ mạnh ánh sáng UV, cho phép chúng ta định lượng và phân tích chúng bằng phương pháp trắc quang UV-Vis. Kem chống nắng hoạt động bằng cách hấp thụ tia UV từ ánh sáng mặt trời, bảo vệ da khỏi tác hại của bức xạ.
Từ bia đến máu: Định luật Beer-Lambert, nền tảng của phương pháp trắc quang, ban đầu được phát triển để đo độ trong của bia. Ngày nay, định luật này được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực, bao gồm cả y học để đo nồng độ hemoglobin trong máu.
Tìm kiếm sự sống ngoài Trái Đất: Trắc quang UV-Vis cũng được sử dụng trong việc tìm kiếm sự sống ngoài Trái Đất. Bằng cách phân tích phổ hấp thụ của khí quyển các hành tinh khác, các nhà khoa học có thể tìm kiếm dấu hiệu của nước và các phân tử hữu cơ, những yếu tố quan trọng cho sự sống.
Nghệ thuật phục chế tranh: Trắc quang được sử dụng để phân tích thành phần của các tác phẩm nghệ thuật, giúp các nhà phục chế xác định các lớp sơn gốc và lựa chọn phương pháp phục chế phù hợp. Kỹ thuật này cho phép “nhìn” xuyên qua các lớp sơn phủ để tìm hiểu lịch sử của bức tranh.
“Dấu vân tay” phân tử: Mỗi phân tử có một phổ hấp thụ UV-Vis đặc trưng, giống như “dấu vân tay” của nó. Điều này cho phép chúng ta xác định và phân biệt các phân tử khác nhau dựa trên phổ hấp thụ của chúng.