Sắc ký Điện di Mao quản (Capillary Electrochromatography – CEC)

Cụ thể, một điện trường cao thế được áp vào hai đầu cột mao quản đã được nhồi pha tĩnh. Điện trường này tạo ra dòng chảy điện thẩm thấu (Electroosmotic Flow – EOF), một dòng chảy đồng nhất có mặt cắt phẳng dạng “nút đẩy” (plug flow). Dạng dòng chảy này giúp giảm thiểu đáng kể hiện tượng khuếch tán băng sắc ký, từ đó mang lại hiệu năng và độ phân giải vượt trội so với dòng chảy parabol do áp suất gây ra trong HPLC. Vì vậy, CEC tận dụng được tính chọn lọc đa dạng của các pha tĩnh trong HPLC và hiệu quả phân tách cực cao của điện di.

2. Nguyên lý hoạt động và Phân tách

Nguyên lý cốt lõi của CEC là sự kết hợp của hai cơ chế vận chuyển và phân tách riêng biệt xảy ra đồng thời trong cột mao quản: dòng chảy điện thẩm thấu (EOF) điều khiển pha động và sự tương tác đa dạng của chất phân tích với điện trường và pha tĩnh.

Dòng chảy điện thẩm thấu (Electroosmotic Flow – EOF): Bề mặt bên trong của cột mao quản silica chứa các nhóm silanol (Si-OH). Khi tiếp xúc với dung dịch đệm có pH > 3, các nhóm này bị deproton hóa thành Si-O⁻, tạo ra một bề mặt tích điện âm. Các cation từ dung dịch đệm sẽ bị hút về phía bề mặt này, hình thành một lớp điện kép. Khi một điện trường được áp vào hai đầu cột, lớp cation khuếch tán (lớp ngoài của lớp điện kép) sẽ di chuyển về phía cực âm, kéo theo toàn bộ dung dịch pha động trong cột. Dòng chảy này được gọi là EOF. Vận tốc của EOF ($v{eof}$) được tính bằng công thức: $v{eof} = \mu{eof}E$, trong đó $\mu{eof}$ là độ linh động điện thẩm và $E$ là cường độ điện trường. Điểm ưu việt của EOF là tạo ra một mặt dòng phẳng dạng “nút đẩy” (plug flow), giúp giảm thiểu sự mở rộng vùng của chất phân tích, mang lại hiệu quả phân tách và số đĩa lý thuyết rất cao.

Cơ chế phân tách kết hợp:
Sự phân tách trong CEC là kết quả tổng hợp của:

• Tương tác sắc ký: Giống như trong HPLC, các chất phân tích (cả trung hòa và tích điện) sẽ phân bố khác nhau giữa pha tĩnh và pha động. Sự lưu giữ này được đặc trưng bởi hệ số lưu giữ (k), làm chậm quá trình di chuyển của chất phân tích so với tốc độ của pha động.
• Tương tác điện di: Các chất phân tích mang điện sẽ di chuyển với một vận tốc riêng ($v_{ep}$) dưới tác dụng của điện trường. Hướng và tốc độ di chuyển phụ thuộc vào tỷ lệ điện tích/kích thước của chúng. Các ion dương sẽ di chuyển về cực âm (cùng chiều với EOF thông thường), trong khi các ion âm di chuyển về cực dương (ngược chiều EOF).

Do đó, vận tốc tổng cộng ($v_{net}$) của một chất phân tích mang điện là sự tổng hợp của vận tốc do EOF, vận tốc điện di của chính nó, và sự kìm hãm do tương tác sắc ký: $v_{net} = (v_{ep} + v_{eof}) \times \frac{1}{1+k}$. Đối với các chất phân tích trung hòa về điện ($v_{ep} = 0$), sự phân tách hoàn toàn dựa trên cơ chế sắc ký.

3. Thiết bị và Cấu tạo

Một hệ thống CEC cơ bản có cấu trúc tương tự hệ thống điện di mao quản (CE) nhưng với sự khác biệt cốt lõi nằm ở cột phân tách. Các bộ phận chính bao gồm:

• Nguồn cao thế: Cung cấp một điện áp DC ổn định (thường từ 5 đến 30 kV) qua hai điện cực đặt trong các lọ đệm ở hai đầu cột để tạo ra điện trường và dòng chảy EOF.
• Cột mao quản: Thường làm bằng silica nung chảy (fused silica) với đường kính trong từ 25-100 µm. Khác với CE, cột trong CEC được nhồi bằng vật liệu pha tĩnh hoặc có pha tĩnh được phủ lên thành trong.
• Pha tĩnh (Stationary Phase): Đây là trái tim của cơ chế sắc ký. Các vật liệu phổ biến bao gồm:
  • Hạt nhồi: Các hạt silica đã được biến tính (ví dụ C18, C8) có kích thước 1.5-5 µm, tương tự như trong HPLC.
  • Vật liệu nguyên khối (Monolith): Một thanh xốp polymer hoặc silica liên tục được tạo ra ngay trong mao quản. Cấu trúc này cho phép dòng chảy dễ dàng hơn và giảm áp suất ngược.
  • Pha tĩnh ở thành mao quản (Open-Tubular – OT): Một lớp mỏng pha tĩnh được phủ hoặc liên kết hóa học với thành trong của mao quản.
• Pha động (Mobile Phase): Thường là một dung dịch đệm (ví dụ: phosphate, acetate) pha với một dung môi hữu cơ (ví dụ: acetonitrile, methanol) để kiểm soát EOF và điều chỉnh khả năng rửa giải của các chất phân tích.
• Hệ thống bơm mẫu: Mẫu được đưa vào đầu cột bằng phương pháp bơm điện động (áp một điện áp trong thời gian ngắn) hoặc bơm thủy động (dùng áp suất).
• Detector: Phổ biến nhất là detector đo độ hấp thụ UV-Vis được tích hợp trực tiếp trên cột (on-column detection) để giảm thiểu thể tích chết. Các detector khác như huỳnh quang (LIF) hoặc khối phổ (MS) cũng được sử dụng để tăng độ nhạy và độ chọn lọc.

4. Các biến thể và Chế độ hoạt động

Tùy thuộc vào cấu trúc cột và cách điều khiển dòng chảy, CEC có một số biến thể chính:

• CEC nhồi cột (Packed CEC): Là dạng phổ biến nhất, sử dụng cột mao quản được nhồi đầy các hạt pha tĩnh. Cung cấp khả năng chọn lọc cao nhưng có thể gặp vấn đề về việc tạo bọt khí và sự ổn định của cột nhồi.
• CEC nguyên khối (Monolithic CEC): Sử dụng cột nguyên khối giúp khắc phục nhiều nhược điểm của cột nhồi, như giảm áp suất ngược và dễ chế tạo hơn, đồng thời cho phép tốc độ dòng cao hơn.
• CEC mao quản mở (Open-Tubular CEC – OT-CEC): Pha tĩnh được phủ trên thành cột. Dạng này không có vấn đề về áp suất ngược nhưng có dung lượng mẫu thấp do tỷ lệ pha thấp.
• CEC điều khiển bằng áp suất (Pressurized CEC – pCEC): Một áp suất phụ được đặt vào hệ thống để hỗ trợ hoặc kiểm soát dòng chảy. Kỹ thuật này rất hữu ích khi cần chạy rửa giải gradient hoặc khi EOF quá yếu, kết hợp linh hoạt giữa động lực của HPLC và CE.

5. Ưu điểm và Nhược điểm

Ưu điểm của CEC

• Hiệu năng phân tách cực cao: Nhờ dòng chảy điện thẩm thấu có mặt dòng chảy phẳng dạng nút đẩy (plug flow), hiện tượng khuếch tán băng sắc ký được giảm thiểu, mang lại số đĩa lý thuyết (N) lớn hơn nhiều so với HPLC. Sự kết hợp của hai cơ chế phân tách (sắc ký và điện di) cho phép phân giải những hỗn hợp phức tạp.
• Khả năng phân tách các hợp chất trung hòa: Đây là ưu điểm vượt trội so với Điện di mao quản (CE) thông thường. Nhờ sự có mặt của pha tĩnh, các phân tử trung hòa về điện vẫn có thể được phân tách dựa trên tương tác sắc ký.
• Linh hoạt và có độ chọn lọc cao: Kế thừa từ HPLC, CEC có thể sử dụng một loạt các loại pha tĩnh và pha động khác nhau, cho phép tối ưu hóa độ chọn lọc cho nhiều loại chất phân tích khác nhau.
• Tiêu thụ ít dung môi và mẫu: Hệ thống sử dụng cột mao quản với thể tích rất nhỏ, do đó lượng mẫu tiêm (chỉ vài nanolít) và lượng dung môi tiêu thụ là không đáng kể so với HPLC, giúp tiết kiệm chi phí và thân thiện với môi trường.

Nhược điểm và Thách thức

• Độ bền và độ lặp lại của cột: Việc nhồi đồng nhất pha tĩnh vào một mao quản có đường kính nhỏ là một thách thức lớn. Cột nhồi không tốt có thể tạo ra các kênh rỗng, gây ra “hiệu ứng thành” và làm giảm hiệu năng. Hơn nữa, sự hình thành bọt khí do hiệu ứng Joule (sinh nhiệt) có thể làm gián đoạn dòng chảy và phá hỏng cột.
• Tính ổn định của dòng chảy điện thẩm thấu (EOF): EOF rất nhạy cảm với những thay đổi nhỏ về thành phần dung dịch đệm (pH, nồng độ ion), nhiệt độ và hóa học bề mặt của pha tĩnh. Điều này có thể dẫn đến độ lặp lại về thời gian lưu thấp hơn so với HPLC.
• Hạn chế trong việc rửa giải gradient: Việc thay đổi thành phần pha động để thực hiện rửa giải gradient (như trong HPLC) là rất khó khăn trong CEC vì nó làm thay đổi mạnh mẽ độ dẫn điện và EOF. Tuy nhiên, biến thể pCEC có thể khắc phục phần nào nhược điểm này.

6. So sánh với các Kỹ thuật liên quan

Bảng dưới đây so sánh các đặc điểm chính của CEC với hai kỹ thuật mẹ của nó là HPLC và CE.

7. Các yếu tố ảnh hưởng đến sự phân tách

Sự thành công của một phép phân tích CEC phụ thuộc vào việc kiểm soát cẩn thận nhiều thông số:

• Điện áp áp dụng: Điện áp cao hơn làm tăng EOF và vận tốc điện di, giúp giảm thời gian phân tích và tăng hiệu năng. Tuy nhiên, điện áp quá cao sẽ gây ra hiệu ứng nhiệt Joule, làm tăng nhiệt độ trong cột, thay đổi độ nhớt pha động và có thể gây ra bọt khí.
• Thành phần pha động:
  • pH của dung dịch đệm: Ảnh hưởng trực tiếp đến mật độ điện tích trên bề mặt pha tĩnh và thành mao quản (quyết định cường độ EOF), cũng như trạng thái ion hóa của các chất phân tích có tính axit/bazơ.
  • Nồng độ dung dịch đệm: Nồng độ cao làm giảm độ dày lớp điện kép, dẫn đến giảm EOF. Nồng độ quá cao cũng làm tăng dòng điện và hiệu ứng nhiệt Joule.
  • Dung môi hữu cơ: Tỷ lệ dung môi hữu cơ (ví dụ: acetonitrile) trong pha động ảnh hưởng đến cả khả năng rửa giải sắc ký và các thông số điện di (hằng số điện môi, độ nhớt).
• Đặc tính pha tĩnh: Loại vật liệu (silica, polymer), hóa học bề mặt (C18, C8,…), và kích thước hạt (hoặc cấu trúc lỗ xốp của vật liệu nguyên khối) quyết định cơ chế tương tác sắc ký và cũng góp phần tạo ra EOF.
• Nhiệt độ: Ảnh hưởng đến độ nhớt của pha động, hằng số cân bằng sắc ký và động học của quá trình. Việc kiểm soát nhiệt độ cột là rất quan trọng để đảm bảo độ lặp lại.

8. Ứng dụng

Nhờ sự kết hợp độc đáo giữa hiệu năng và tính chọn lọc, CEC được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực đòi hỏi khả năng phân tách cao các hỗn hợp phức tạp:

• Phân tích dược phẩm: Định lượng hoạt chất, phân tích các đồng phân đối quang, xác định tạp chất và sản phẩm phân hủy trong thuốc.
• Khoa học sự sống và Công nghệ sinh học: Phân tích các phân tử sinh học như peptide, protein, axit nucleic và carbohydrate.
• Phân tích môi trường: Phát hiện các chất ô nhiễm hữu cơ bền (POP), thuốc trừ sâu, và các hợp chất đa vòng thơm (PAH) ở nồng độ vết.
• Phân tích thực phẩm: Xác định các chất phụ gia, chất bảo quản, vitamin, và các hợp chất tự nhiên trong ma trận thực phẩm.
• Hóa học pháp y: Phân tích ma túy, chất độc và các bằng chứng vi lượng.