Sắc ký Điều chế (Preparative Chromatography)

Nguyên tắc hoạt động

Nguyên tắc cơ bản của sắc ký điều chế tương tự như sắc ký phân tích, dựa trên sự phân bố khác nhau của các chất giữa hai pha không trộn lẫn:

• Pha tĩnh (Stationary Phase): Là một chất rắn hoặc một chất lỏng được giữ cố định trên một chất mang rắn, thường được nạp vào cột sắc ký. Pha tĩnh có thể là các hạt silica gel, polymer, hoặc các vật liệu khác có khả năng tương tác với các chất cần tách.
• Pha động (Mobile Phase): Là một chất lỏng hoặc khí di chuyển qua pha tĩnh, mang theo hỗn hợp mẫu cần tách. Pha động có thể là một dung môi đơn, hỗn hợp dung môi, hoặc khí trơ, tùy thuộc vào loại sắc ký và các chất cần tách.

Các chất trong hỗn hợp mẫu sẽ tương tác khác nhau với pha tĩnh và pha động. Sự khác biệt về ái lực của các chất với hai pha là yếu tố quyết định sự tách biệt. Các chất có ái lực mạnh hơn với pha tĩnh sẽ di chuyển chậm hơn (bị giữ lại lâu hơn), trong khi các chất có ái lực mạnh hơn với pha động sẽ di chuyển nhanh hơn. Sự khác biệt về tốc độ di chuyển này dẫn đến sự tách biệt các chất thành các dải (band) riêng biệt khi chúng đi qua cột.

Các loại sắc ký Điều chế

Có nhiều loại sắc ký điều chế khác nhau, được phân loại dựa trên cơ chế tách và loại pha tĩnh, pha động sử dụng:

• Sắc ký cột (Column Chromatography): Đây là loại sắc ký điều chế phổ biến nhất. Pha tĩnh được nạp vào một cột thủy tinh hoặc kim loại, và pha động được cho chảy qua cột nhờ trọng lực hoặc áp suất (bơm).
• Sắc ký lỏng hiệu năng cao điều chế (Preparative HPLC): Là một dạng cải tiến của sắc ký cột, sử dụng áp suất cao để đẩy pha động qua cột chứa pha tĩnh có kích thước hạt rất nhỏ. Điều này giúp tăng hiệu quả tách, độ phân giải cao và giảm thời gian phân tích. Preparative HPLC thường được sử dụng để tinh chế các hợp chất có giá trị cao hoặc khó tách.
• Sắc ký khí điều chế (Preparative GC): Sử dụng pha động là khí (thường là heli hoặc nitơ) và pha tĩnh là một chất lỏng được phủ trên một chất mang rắn. Preparative GC thường được sử dụng để tách các hợp chất dễ bay hơi và bền nhiệt.
• Sắc ký trao đổi ion (Ion Exchange Chromatography): Dựa trên sự tương tác tĩnh điện giữa các ion của chất cần tách và các nhóm chức tích điện trên pha tĩnh. Kỹ thuật này thường được sử dụng để tách các phân tử sinh học như protein và axit nucleic.
• Sắc ký ái lực (Affinity Chromatography): Dựa trên sự tương tác đặc hiệu (khóa – chìa) giữa chất cần tách và một phối tử (ligand) được gắn trên pha tĩnh. Đây là phương pháp có độ chọn lọc rất cao, thường được sử dụng để tinh chế các protein, enzyme, và kháng thể.
• Sắc ký lọc gel (Gel Filtration Chromatography) hay Sắc ký rây phân tử (Size Exclusion Chromatography): Tách các chất dựa trên kích thước phân tử của chúng. Pha tĩnh là một vật liệu xốp có kích thước lỗ xác định. Các phân tử lớn hơn không thể đi vào lỗ xốp nên sẽ đi qua cột nhanh hơn (elute trước), trong khi các phân tử nhỏ hơn có thể đi vào lỗ xốp và bị giữ lại lâu hơn (elute sau).
• Sắc ký lớp mỏng điều chế (Preparative Thin Layer Chromatography): Sử dụng một lớp mỏng chất hấp phụ như silica gel được trải trên một tấm kính, nhôm hoặc nhựa làm pha tĩnh và dung môi được đưa lên nhờ mao dẫn. So với sắc ký lớp mỏng thông thường, lớp chất hấp phụ trong sắc ký lớp mỏng điều chế dày hơn đáng kể.

Ứng dụng

Sắc ký điều chế có nhiều ứng dụng quan trọng trong nhiều lĩnh vực:

• Công nghiệp dược phẩm: Tinh chế các hoạt chất dược phẩm, loại bỏ tạp chất và sản phẩm phụ, đảm bảo chất lượng và độ an toàn của thuốc.
• Công nghiệp hóa chất: Tinh chế các hợp chất hóa học, sản xuất các hóa chất tinh khiết sử dụng trong sản xuất, nghiên cứu và phân tích.
• Công nghệ sinh học: Tinh chế protein, enzyme, kháng thể và các sản phẩm sinh học khác, phục vụ cho nghiên cứu, chẩn đoán và điều trị bệnh.
• Nghiên cứu khoa học: Phân lập và tinh chế các hợp chất tự nhiên (từ thực vật, động vật, vi sinh vật), tổng hợp các hợp chất mới để nghiên cứu cấu trúc, tính chất và hoạt tính sinh học.
• Công nghiệp thực phẩm: Tinh chế các phụ gia tạo màu, tạo mùi, các chất dinh dưỡng.

Ưu điểm và nhược điểm

• Ưu điểm:
  • Khả năng tinh chế một lượng lớn chất: Đây là ưu điểm chính của sắc ký điều chế, cho phép thu được lượng sản phẩm đủ lớn cho các ứng dụng tiếp theo.
  • Độ tinh khiết cao của sản phẩm thu được: Sắc ký điều chế có thể loại bỏ hiệu quả các tạp chất, sản phẩm phụ, và các chất không mong muốn khác, tạo ra sản phẩm có độ tinh khiết cao.
  • Có thể áp dụng cho nhiều loại hợp chất khác nhau: Sắc ký điều chế có thể được sử dụng để tinh chế nhiều loại hợp chất khác nhau, từ các phân tử nhỏ đến các đại phân tử sinh học.
  • Có nhiều kỹ thuật khác nhau để lựa chọn, phù hợp với từng loại mẫu: Tùy thuộc vào tính chất của mẫu và mục tiêu tinh chế, người dùng có thể lựa chọn kỹ thuật sắc ký điều chế phù hợp nhất.
• Nhược điểm:
  • Chi phí đầu tư ban đầu cao (thiết bị, hóa chất): Hệ thống sắc ký điều chế, đặc biệt là các hệ thống HPLC điều chế, thường có chi phí đầu tư ban đầu cao.
  • Quy trình phức tạp, đòi hỏi kỹ thuật viên có kinh nghiệm: Việc phát triển và tối ưu hóa phương pháp sắc ký điều chế đòi hỏi kiến thức chuyên môn và kinh nghiệm thực tế.
  • Có thể tốn kém thời gian và dung môi: Quá trình sắc ký điều chế có thể mất nhiều thời gian, đặc biệt là khi tinh chế lượng lớn mẫu, và tiêu thụ một lượng lớn dung môi.
  • Khó khăn trong việc mở rộng quy mô (scale-up) từ phòng thí nghiệm lên sản xuất công nghiệp: Việc chuyển đổi từ quy mô phòng thí nghiệm sang quy mô công nghiệp đòi hỏi phải tối ưu hóa lại các thông số và có thể gặp khó khăn trong việc duy trì hiệu suất tách. Lượng mẫu nạp vào cột có giới hạn, nếu nạp quá nhiều mẫu vào cột thì các peak sắc ký có thể bị chồng lấn lên nhau.

Các thông số quan trọng

• Độ phân giải (Resolution, (R_s)): Thể hiện mức độ tách biệt giữa hai chất. (R_s) càng lớn, sự tách biệt càng tốt. ( Rs = \frac{2(t{R2} – t_{R1})}{w_1 + w2}) trong đó, (t{R1}) và (t_{R2}) là thời gian lưu của chất 1 và 2. (w_1) và (w_2) là độ rộng đáy pic của chất 1 và 2.
• Hệ số dung lượng (Capacity Factor, (k’)): (k’ = \frac{t_R – t_M}{t_M}) trong đó (t_R) là thời gian lưu của chất cần tách, (t_M) là thời gian chết (thời gian lưu của chất không bị giữ lại). Hệ số (k’) cho biết khả năng tương tác của chất phân tích với pha tĩnh.
• Số đĩa lý thuyết (Number of Theoretical Plates, N): ( N = 16(\frac{t_R}{w})^2 = 5.54(\frac{tR}{w{1/2}})^2) trong đó (w) là độ rộng đáy pic, (w_{1/2}) là độ rộng pic tại nửa chiều cao. Số đĩa lý thuyết càng lớn thì cột có hiệu năng tách càng cao.
• Hệ số không đối xứng (Asymmetry factor, (A_s)): (A_s = \frac{b}{a}) với a là khoảng cách từ điểm đầu pic đến đường thẳng vuông góc hạ từ đỉnh pic, và b là khoảng cách từ đường thẳng vuông góc hạ từ đỉnh pic đến điểm cuối pic. Hệ số (A_s) mô tả hình dạng của pic sắc ký. Giá trị (A_s) = 1 thể hiện pic đối xứng, (A_s) > 1 thể hiện pic bị kéo đuôi (tailing) và (A_s) <1 thể hiện pic bị gù đầu (fronting).

Tóm lại, Sắc ký Điều chế là một công cụ mạnh mẽ và linh hoạt để tinh chế các chất ở quy mô lớn. Sự lựa chọn kỹ thuật sắc ký điều chế phù hợp phụ thuộc vào tính chất của mẫu, độ tinh khiết yêu cầu và quy mô sản xuất.

Tối ưu hóa quy trình sắc ký điều chế

Để đạt được hiệu quả tách tốt nhất và thu được sản phẩm có độ tinh khiết cao, việc tối ưu hóa quy trình sắc ký điều chế là rất quan trọng. Các yếu tố cần xem xét bao gồm:

• Lựa chọn pha tĩnh:
  • Tính chọn lọc (Selectivity): Khả năng của pha tĩnh trong việc phân biệt giữa các chất khác nhau trong hỗn hợp. Pha tĩnh có tính chọn lọc cao sẽ giúp tách các chất có cấu trúc tương tự nhau tốt hơn.
  • Khả năng tải (Loading Capacity): Lượng mẫu tối đa có thể nạp vào cột mà không làm giảm độ phân giải. Khả năng tải của pha tĩnh phụ thuộc vào diện tích bề mặt riêng và mật độ nhóm chức.
  • Kích thước hạt (Particle Size): Hạt nhỏ hơn cung cấp độ phân giải cao hơn nhưng tạo ra áp suất ngược (back pressure) lớn hơn. Việc lựa chọn kích thước hạt là sự cân bằng giữa độ phân giải và áp suất.
  • Độ ổn định hóa học (Chemical Stability): Pha tĩnh phải bền vững trong điều kiện pha động và mẫu, không bị phân hủy hoặc biến tính.
• Lựa chọn pha động:
  • Độ phân cực (Polarity): Phải phù hợp với độ phân cực của các chất cần tách. Nguyên tắc chung là “like dissolves like” (chất phân cực tan trong dung môi phân cực, chất không phân cực tan trong dung môi không phân cực).
  • Độ nhớt (Viscosity): Độ nhớt thấp giúp giảm áp suất ngược và tăng tốc độ dòng chảy.
  • Khả năng hòa tan (Solubility): Pha động phải hòa tan tốt các chất trong mẫu để tránh kết tủa hoặc gây tắc nghẽn cột.
  • pH: Có thể điều chỉnh pH để cải thiện sự tách biệt, đặc biệt đối với các hợp chất ion hóa. Việc kiểm soát pH có thể ảnh hưởng đến trạng thái ion hóa của chất phân tích và pha tĩnh, từ đó thay đổi ái lực của chúng.
  • Sử dụng gradient: Thay đổi thành phần pha động theo thời gian (gradient elution) có thể cải thiện độ phân giải đối với các hỗn hợp phức tạp. Gradient thường được sử dụng trong HPLC để tách các chất có độ phân cực khác nhau rộng.
• Điều kiện sắc ký:
  • Tốc độ dòng (Flow Rate): Tốc độ dòng tối ưu phụ thuộc vào kích thước cột, kích thước hạt pha tĩnh và độ nhớt của pha động. Tốc độ dòng quá cao có thể làm giảm độ phân giải, trong khi tốc độ dòng quá thấp có thể làm tăng thời gian phân tích.
  • Nhiệt độ (Temperature): Có thể ảnh hưởng đến độ chọn lọc và độ nhớt của pha động. Tăng nhiệt độ thường làm giảm độ nhớt và tăng tốc độ khuếch tán, nhưng cũng có thể làm giảm độ ổn định của một số chất.
  • Kích thước cột (Column Dimensions): Cột dài hơn và đường kính lớn hơn cho phép nạp lượng mẫu lớn hơn nhưng cũng làm tăng thời gian phân tích và tiêu thụ dung môi.
  • Hệ thống phát hiện (Detection System): Lựa chọn detector phù hợp với tính chất của các chất cần tách (ví dụ: UV, RI, MS). Detector UV thường được sử dụng cho các hợp chất hấp thụ UV, detector RI (chỉ số khúc xạ) phù hợp cho các chất không hấp thụ UV, và detector MS (khối phổ) cung cấp thông tin về khối lượng phân tử và cấu trúc của chất phân tích.
• Nạp mẫu:
  • Thể tích mẫu nạp vào không được quá lớn, nếu không sẽ làm giảm độ phân giải của cột.
  • Nồng độ mẫu cũng cần được tối ưu hóa. Nồng độ quá cao có thể gây quá tải cột, trong khi nồng độ quá thấp có thể làm giảm độ nhạy của detector.
  • Dung môi hòa tan mẫu lý tưởng là pha động, hoặc dung môi có độ rửa giải (elution strength) yếu hơn pha động. Điều này giúp tránh hiện tượng “peak broadening” (pic bị mở rộng) do dung môi mẫu gây ra.
• Thu mẫu:
  • Việc thu mẫu (fraction collection) có thể thực hiện thủ công hoặc tự động dựa trên tín hiệu từ detector.
  • Thể tích các phân đoạn thu được cần được tối ưu, tránh trộn lẫn giữa các chất đã được tách ra.

Kỹ thuật sắc ký điều chế nâng cao

Ngoài các kỹ thuật sắc ký điều chế cơ bản, còn có một số kỹ thuật nâng cao được phát triển để giải quyết các thách thức cụ thể:

• Sắc ký ngược pha (Reversed-Phase Chromatography, RPC): Là một dạng của HPLC, trong đó pha tĩnh không phân cực (ví dụ: C18, C8) và pha động phân cực (ví dụ: hỗn hợp nước-acetonitrile hoặc nước-methanol). Đây là kỹ thuật sắc ký lỏng được sử dụng rộng rãi nhất do khả năng tách được nhiều loại hợp chất khác nhau.
• Sắc ký dòng ngược (Countercurrent Chromatography, CCC): Sử dụng hai pha lỏng không trộn lẫn, trong đó một pha được giữ cố định bằng lực ly tâm, và pha còn lại được bơm qua. CCC không sử dụng chất mang rắn, giúp loại bỏ các vấn đề liên quan đến hấp phụ không thuận nghịch trên pha tĩnh.
• Sắc ký giả di động (Simulated Moving Bed Chromatography, SMB): Là một kỹ thuật sắc ký liên tục, trong đó pha tĩnh và pha động di chuyển ngược chiều nhau một cách mô phỏng. SMB cho phép tách các hỗn hợp phức tạp với hiệu suất cao và tiêu thụ ít dung môi, đặc biệt hiệu quả cho việc tách các hỗn hợp đối quang (enantiomers).
• Sắc ký hai chiều (Two-Dimensional Chromatography, 2D-LC): Kỹ thuật này kết hợp hai cột sắc ký khác nhau về cơ chế tách (ví dụ: cột ngược pha và cột trao đổi ion). Kỹ thuật này có thể được sử dụng khi sắc ký một chiều không thể giải quyết được các peak.
• Sắc ký siêu tới hạn (Supercritical Fluid Chromatography, SFC): Pha động là một chất siêu tới hạn, thường là CO2. SFC có thể được coi là “lai” giữa sắc ký khí và sắc ký lỏng, kết hợp ưu điểm của cả hai kỹ thuật này. Nó đặc biệt hữu ích cho việc tách các hợp chất không phân cực và các hợp chất chiral.

Tài liệu tham khảo

• Skoog, D. A., Holler, F. J., & Crouch, S. R. (2017). Principles of instrumental analysis. Cengage learning.
• Meyer, V. R. (2010). Practical high-performance liquid chromatography. John Wiley & Sons.
• Guiochon, G., & Beaver, L. A. (2011). Preparative liquid chromatography. Journal of Chromatography Library, 74.
• Subramanian, G. (Ed.). (2007). Preparative chromatography: techniques and instrumentation. John Wiley & Sons.
• Hostettmann, K., Marston, A., & Hostettmann, M. (1998). Preparative chromatography techniques: applications in natural product isolation. Springer Science & Business Media.
• Snyder, L. R., Kirkland, J. J., & Glajch, J. L. (1997). Practical HPLC method development. John Wiley & Sons.

Câu hỏi và Giải đáp

Làm thế nào để lựa chọn giữa sắc ký lỏng hiệu năng cao điều chế (Preparative HPLC) và sắc ký cột thường trong một ứng dụng cụ thể?

Trả lời: Việc lựa chọn giữa Preparative HPLC và sắc ký cột thường phụ thuộc vào nhiều yếu tố:

• Quy mô: Đối với lượng mẫu nhỏ (vài miligam đến vài gram), sắc ký cột thường có thể đủ. Tuy nhiên, khi cần tinh chế lượng lớn hơn (vài gram đến kilogam), Preparative HPLC thường là lựa chọn tốt hơn vì nó có khả năng tải cao hơn và hiệu quả tách tốt hơn.
• Độ phức tạp của mẫu: Nếu hỗn hợp mẫu đơn giản (chỉ có vài thành phần), sắc ký cột thường có thể giải quyết được. Nhưng đối với hỗn hợp phức tạp (nhiều thành phần, các chất có tính chất gần giống nhau), Preparative HPLC với độ phân giải cao hơn sẽ là lựa chọn phù hợp.
• Độ tinh khiết yêu cầu: Nếu yêu cầu độ tinh khiết rất cao, Preparative HPLC thường là lựa chọn tốt hơn vì nó cung cấp độ phân giải tốt hơn và khả năng kiểm soát các thông số tốt hơn.
• Thời gian và chi phí: Sắc ký cột thường tốn ít thời gian và chi phí hơn so với Preparative HPLC (chi phí thiết bị, vận hành, bảo trì). Nếu thời gian và chi phí là yếu tố quan trọng, sắc ký cột thường có thể là lựa chọn hợp lý, miễn là nó đáp ứng được yêu cầu về độ tinh khiết và quy mô.
• Khả năng scale-up: Nếu có ý định scale-up qui trình, preparative HPLC dễ scale-up hơn so với sắc ký cột thường.

“Sắc ký ngược pha” (Reversed-Phase Chromatography – RPC) là gì và tại sao nó lại phổ biến trong sắc ký điều chế?

Trả lời: Sắc ký ngược pha (RPC) là một loại sắc ký lỏng, trong đó pha tĩnh không phân cực (ví dụ: các chuỗi hydrocarbon dài như C18, C8 gắn trên silica) và pha động phân cực (ví dụ: hỗn hợp nước và acetonitrile hoặc methanol).

RPC phổ biến vì:

• Khả năng ứng dụng rộng: Nó có thể tách được nhiều loại hợp chất khác nhau, từ các hợp chất không phân cực đến các hợp chất phân cực vừa phải và thậm chí cả các hợp chất ion hóa (bằng cách sử dụng các chất tạo cặp ion).
• Độ ổn định: Pha tĩnh RPC (đặc biệt là các pha tĩnh silica đã được biến tính) thường bền vững trong nhiều điều kiện pH và dung môi khác nhau.
• Dễ dàng kiểm soát: Độ chọn lọc của RPC có thể được điều chỉnh dễ dàng bằng cách thay đổi thành phần pha động (tỷ lệ dung môi hữu cơ, pH, thêm chất tạo cặp ion).
• Có sẵn nhiều loại pha tĩnh: Có rất nhiều loại pha tĩnh RPC khác nhau (C18, C8, C4, phenyl, cyano,…) cho phép lựa chọn phù hợp với từng ứng dụng cụ thể.

Hệ số bất đối xứng ((A_s)) của pic sắc ký có ý nghĩa gì và làm thế nào để cải thiện nó?

Trả lời: Hệ số bất đối xứng ((A_s)) là một thước đo hình dạng của pic sắc ký. (A_s = frac{b}{a}), trong đó a là khoảng cách từ điểm bắt đầu pic đến đường thẳng vuông góc hạ từ đỉnh pic, và b là khoảng cách từ đường thẳng vuông góc hạ từ đỉnh pic đến điểm kết thúc pic.

• (A_s) = 1: Pic đối xứng (lý tưởng).
• (A_s) > 1: Pic bị “đuôi” (tailing).
• (A_s) < 1: Pic bị “méo đầu” (fronting).

Pic bị méo (không đối xứng) có thể làm giảm độ phân giải và gây khó khăn trong việc định lượng chính xác.

Để cải thiện (A_s):

• Tối ưu hóa pha động: Thay đổi pH, thêm chất phụ gia (ví dụ: triethylamine để giảm tailing của các bazơ).
• Thay đổi pha tĩnh: Chọn loại pha tĩnh khác có tương tác phù hợp hơn với chất phân tích.
• Giảm tải lượng mẫu: Tải quá nhiều mẫu có thể gây ra hiện tượng quá tải cột (overloading), dẫn đến pic bị méo.
• Kiểm tra hệ thống: Đảm bảo hệ thống sắc ký không có “khoảng chết” (dead volume) hoặc các vấn đề khác có thể gây ra méo pic.

Sắc ký giả di động (Simulated Moving Bed Chromatography – SMB) hoạt động như thế nào?

Trả lời: SMB là một kỹ thuật sắc ký liên tục, mô phỏng sự di chuyển ngược chiều của pha tĩnh và pha động. Trong thực tế, pha tĩnh không di chuyển, mà thay vào đó, người ta sử dụng một hệ thống van để chuyển đổi tuần hoàn vị trí các cột sắc ký và các cổng vào/ra của mẫu và pha động.

SMB hoạt động dựa trên nguyên tắc:

1. Nạp mẫu liên tục: Mẫu được nạp liên tục vào một trong các cột.
2. Rửa giải: Pha động được bơm liên tục qua các cột.
3. Thu sản phẩm: Các sản phẩm được tách ra được thu liên tục ở các cổng ra khác nhau.
4. Chuyển đổi cột: Sau một khoảng thời gian nhất định, hệ thống van sẽ chuyển đổi vị trí các cột, cổng nạp mẫu và cổng thu sản phẩm, tạo ra hiệu ứng tương tự như pha tĩnh đang di chuyển ngược chiều với pha động.

SMB có ưu điểm:

• Hiệu suất cao: Tách được các hỗn hợp khó tách với độ tinh khiết cao.
• Tiết kiệm dung môi: Tiêu thụ ít dung môi hơn so với sắc ký điều chế thông thường.
• Liên tục: Quá trình diễn ra liên tục, không bị gián đoạn bởi các bước nạp mẫu và rửa giải riêng lẻ.

Gradient elution là gì và khi nào nên sử dụng nó trong sắc ký điều chế?
Trả lời: Gradient elution là kỹ thuật thay đổi thành phần pha động theo thời gian trong quá trình chạy sắc ký. Thay vì giữ nguyên tỉ lệ dung môi, tỉ lệ này sẽ được thay đổi (thường là tăng dần độ mạnh rửa giải của dung môi)
Gradient elution được sử dụng khi:

• Mẫu có chứa các chất có độ phân cực khác nhau nhiều. Nếu sử dụng dung môi đẳng dòng (isocratic), các chất ít phân cực sẽ bị giữ lại rất mạnh và có thời gian lưu rất dài, trong khi các chất phân cực mạnh có thể không được tách tốt. Sử dụng gradient (tăng dần độ phân cực của pha động) giúp rửa giải các chất ít phân cực nhanh hơn và cải thiện độ phân giải tổng thể.
• Mẫu phức tạp chứa nhiều chất. Gradient giúp cải thiện độ phân giải của các pic và giảm thời gian phân tích.
• Cần cải thiện hình dạng pic. Đôi khi, gradient có thể giúp giảm hiện tượng tailing hoặc fronting của pic.