Sắc ký lọc gel (Size exclusion chromatography/Gel permeation chromatography)

Sắc ký lọc gel, còn được gọi là sắc ký thẩm gel (Gel Permeation Chromatography, GPC), là một kỹ thuật sắc ký lỏng được sử dụng để phân tách các phân tử dựa trên kích thước của chúng. Khác với các phương pháp sắc ký khác dựa trên tương tác hóa học giữa chất tan và pha tĩnh, sắc ký lọc gel chủ yếu dựa trên sự khác biệt về kích thước và hình dạng của các phân tử khi chúng di chuyển qua một pha tĩnh xốp.

Nguyên lý

Pha tĩnh trong sắc ký lọc gel là một gel xốp, thường được làm từ các hạt polymer như dextran, agarose hoặc polyacrylamide. Gel này có cấu trúc mạng lưới với các lỗ có kích thước khác nhau. Khi mẫu chứa hỗn hợp các phân tử có kích thước khác nhau được đưa vào cột sắc ký, các phân tử nhỏ hơn sẽ khuếch tán vào các lỗ trong hạt gel, trong khi các phân tử lớn hơn bị loại trừ và di chuyển nhanh hơn theo dòng dung môi. Kết quả là các phân tử lớn hơn sẽ được rửa giải ra khỏi cột trước, tiếp theo là các phân tử có kích thước trung bình và cuối cùng là các phân tử nhỏ nhất. Thời gian lưu của một phân tử trong cột tỉ lệ nghịch với kích thước của nó. Các phân tử lớn hơn, không thể xâm nhập vào lỗ xốp, sẽ di chuyển nhanh qua cột và bị rửa giải trước. Các phân tử nhỏ hơn sẽ mất nhiều thời gian hơn để di chuyển qua cột vì chúng bị giữ lại trong các lỗ xốp của gel.

Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình tách

Các yếu tố sau đây ảnh hưởng đến quá trình tách trong sắc ký lọc gel:

Kích thước lỗ của gel: Kích thước lỗ của gel quyết định phạm vi phân tách kích thước phân tử. Gel có lỗ nhỏ thích hợp cho việc tách các phân tử nhỏ, trong khi gel có lỗ lớn thích hợp cho việc tách các phân tử lớn. Việc lựa chọn loại gel phù hợp với phạm vi kích thước của các phân tử cần phân tách là rất quan trọng.
Lưu lượng dung môi: Lưu lượng dung môi ảnh hưởng đến thời gian lưu của các phân tử trong cột. Lưu lượng quá nhanh sẽ làm giảm hiệu quả tách, trong khi lưu lượng quá chậm sẽ làm tăng thời gian phân tích. Cần tối ưu hóa lưu lượng để đạt được hiệu quả tách tốt nhất trong thời gian ngắn nhất.
Loại dung môi: Dung môi phải hòa tan mẫu và tương thích với pha tĩnh. Độ nhớt và khả năng tương tác của dung môi với mẫu và pha tĩnh cũng ảnh hưởng đến quá trình tách.
Nhiệt độ: Nhiệt độ ảnh hưởng đến độ nhớt của dung môi và do đó ảnh hưởng đến tốc độ khuếch tán của các phân tử. Việc kiểm soát nhiệt độ giúp đảm bảo tính lặp lại của quá trình tách.

Ứng dụng

Sắc ký lọc gel được sử dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực, bao gồm:

Xác định khối lượng phân tử: Bằng cách so sánh thời gian lưu của mẫu với thời gian lưu của các chất chuẩn có khối lượng phân tử đã biết, có thể xác định được khối lượng phân tử của mẫu. Phương pháp này thường được sử dụng để xác định khối lượng phân tử trung bình số ($M_n$) và khối lượng phân tử trung bình trọng lượng ($M_w$) của polymer.
Phân tách và tinh sạch protein: Sắc ký lọc gel được sử dụng để phân tách các protein khác nhau dựa trên kích thước của chúng.
Phân tách polymer: GPC là một kỹ thuật quan trọng để xác định phân bố khối lượng phân tử của polymer.
Phân tích carbohydrate: Sắc ký lọc gel có thể được sử dụng để phân tách và phân tích các loại carbohydrate khác nhau.
Loại bỏ muối và các phân tử nhỏ: Sắc ký lọc gel có thể được sử dụng để loại bỏ muối và các phân tử nhỏ khỏi mẫu protein hoặc polymer. Quá trình này thường được gọi là “desalting”.

Ưu điểm

Sắc ký lọc gel có nhiều ưu điểm, bao gồm:

Tách nhanh và hiệu quả.
Điều kiện vận hành đơn giản.
Mẫu thu hồi cao.
Ít ảnh hưởng đến hoạt tính sinh học của mẫu.

Nhược điểm

Mặc dù có nhiều ưu điểm, sắc ký lọc gel cũng có một số nhược điểm:

Phạm vi phân tách hạn chế: Sắc ký lọc gel chỉ có thể phân tách các phân tử có sự khác biệt về kích thước đáng kể.
Cần lượng mẫu tương đối lớn: So với một số kỹ thuật sắc ký khác, sắc ký lọc gel thường yêu cầu lượng mẫu lớn hơn.
Khó phân tách các phân tử có kích thước tương tự nhau: Nếu các phân tử có kích thước gần giống nhau, chúng sẽ khó bị phân tách hoàn toàn bằng sắc ký lọc gel.

Khối lượng phân tử trung bình ($M_n$) và khối lượng phân tử trung bình trọng lượng ($M_w$)

$M_n = \frac{\sum N_i M_i}{\sum N_i}$

$M_w = \frac{\sum N_i M_i^2}{\sum N_i M_i}$

Trong đó:

$N_i$ là số lượng phân tử có khối lượng phân tử $M_i$.

Chỉ số đa phân tán (PDI)

$PDI = \frac{M_w}{M_n}$

PDI là một thước đo độ rộng của phân bố khối lượng phân tử. Giá trị PDI càng gần 1 thì phân bố khối lượng phân tử càng hẹp, tức là các phân tử trong mẫu có kích thước đồng đều hơn.

Các loại gel thường dùng

Dextran: Thường được sử dụng cho việc tách các phân tử có khối lượng phân tử nhỏ và trung bình. Các gel dextran thương mại thường được biết đến với tên gọi Sephadex.
Agarose: Thường được sử dụng cho việc tách các phân tử có khối lượng phân tử lớn, đặc biệt là các protein và axit nucleic. Các gel agarose thương mại thường được biết đến với tên gọi Sepharose.
Polyacrylamide: Cũng được sử dụng cho việc tách các phân tử có khối lượng phân tử nhỏ và trung bình. Gel polyacrylamide có thể được điều chế với kích thước lỗ được kiểm soát chặt chẽ.
Silica và kính xốp: Được sử dụng trong sắc ký thẩm gel hiệu năng cao (HPSEC) hoặc GPC áp suất cao (HPGPC). Chúng có khả năng chịu áp suất cao và cho phép phân tách nhanh hơn.

So sánh Sắc ký Lọc Gel với các kỹ thuật sắc ký khác

Sắc ký lọc gel khác biệt với các kỹ thuật sắc ký lỏng khác ở cơ chế tách. Trong khi các kỹ thuật như sắc ký hấp phụ, sắc ký trao đổi ion và sắc ký ái lực dựa trên tương tác hóa học giữa chất tan và pha tĩnh, sắc ký lọc gel tách các phân tử dựa trên kích thước của chúng. Điều này có nghĩa là trong sắc ký lọc gel, không có tương tác hóa học giữa chất tan và pha tĩnh, làm cho nó trở thành một kỹ thuật “không phá hủy” và rất hữu ích cho việc tinh chế các phân tử sinh học nhạy cảm.

Sắc ký thẩm gel hiệu năng cao (HPSEC) hoặc GPC áp suất cao (HPGPC)

Đây là một phiên bản cải tiến của GPC truyền thống, sử dụng các hạt gel nhỏ hơn và áp suất cao hơn. HPSEC cho phép phân tách nhanh hơn và độ phân giải cao hơn so với GPC truyền thống.

Hiệu chuẩn (Calibration)

Để xác định khối lượng phân tử của một chất chưa biết bằng GPC, cần phải hiệu chuẩn cột bằng các chất chuẩn có khối lượng phân tử đã biết. Một đường chuẩn được vẽ bằng cách vẽ logarit của khối lượng phân tử của các chất chuẩn theo thời gian lưu của chúng. Từ đường chuẩn này, có thể xác định được khối lượng phân tử của chất chưa biết dựa trên thời gian lưu của nó.

Ứng dụng cụ thể

Trong ngành công nghiệp dược phẩm: GPC được sử dụng để phân tích và kiểm soát chất lượng của protein trị liệu, polymer sinh học và các loại thuốc khác.
Trong ngành công nghiệp thực phẩm: GPC được sử dụng để phân tích thành phần carbohydrate và protein trong thực phẩm.
Trong nghiên cứu môi trường: GPC được sử dụng để phân tích các chất ô nhiễm trong nước và đất.

Tóm tắt về Sắc ký lọc gel

Sắc ký lọc gel (SEC), còn được gọi là sắc ký thấm gel (GPC), là một kỹ thuật mạnh mẽ để phân tách các phân tử dựa trên kích thước. Nguyên lý cốt lõi của SEC là sự phân tách kích thước do sự tương tác khác biệt của các phân tử với pha tĩnh xốp. Các phân tử nhỏ hơn thâm nhập vào các lỗ của gel, dẫn đến thời gian lưu lâu hơn, trong khi các phân tử lớn hơn bị loại trừ khỏi các lỗ và rửa giải nhanh hơn.

Việc lựa chọn loại gel phù hợp là rất quan trọng cho việc phân tách hiệu quả. Các loại gel khác nhau như dextran, agarose, polyacrylamide và silica xốp, cung cấp các phạm vi kích thước lỗ khác nhau để phù hợp với các ứng dụng phân tách khác nhau. Kích thước lỗ của gel quyết định phạm vi khối lượng phân tử mà kỹ thuật có thể phân tích.

Hiệu chuẩn là một bước thiết yếu trong SEC để xác định khối lượng phân tử của các chất chưa biết. Bằng cách sử dụng các chất chuẩn có khối lượng phân tử đã biết, có thể thiết lập mối quan hệ giữa thời gian lưu và khối lượng phân tử. Đường chuẩn này cho phép xác định khối lượng phân tử của các mẫu chưa biết dựa trên thời gian lưu của chúng. $M_n$ và $M_w$ là các thông số quan trọng được xác định từ dữ liệu SEC.

SEC có nhiều ứng dụng trong các lĩnh vực khác nhau. Nó được sử dụng rộng rãi để xác định khối lượng phân tử và phân bố khối lượng phân tử của polymer, phân tách và tinh sạch protein, và phân tích các phân tử sinh học khác. Tính linh hoạt và khả năng tương thích với nhiều loại mẫu làm cho SEC trở thành một công cụ có giá trị trong nghiên cứu khoa học, kiểm soát chất lượng và nhiều ứng dụng công nghiệp.

Tài liệu tham khảo:

Skoog, D. A., Holler, F. J., & Crouch, S. R. (2017). Principles of instrumental analysis. Cengage learning.
Harris, D. C. (2010). Quantitative chemical analysis. W. H. Freeman.
Yau, W. W., Kirkland, J. J., & Bly, D. D. (2001). Modern size-exclusion liquid chromatography: Practice of gel permeation and gel filtration chromatography. John Wiley & Sons.
Hunt, B. J., & Holding, S. R. (2017). Size exclusion chromatography. Springer.

Câu hỏi và Giải đáp

Làm thế nào để chọn loại gel phù hợp cho một ứng dụng SEC cụ thể?

Trả lời: Việc lựa chọn gel phụ thuộc vào phạm vi khối lượng phân tử của các chất phân tích cần phân tách. Kích thước lỗ của gel phải phù hợp với kích thước của các phân tử. Ví dụ, gel có lỗ nhỏ được sử dụng cho các phân tử nhỏ, trong khi gel có lỗ lớn được sử dụng cho các phân tử lớn. Thông tin về phạm vi phân tách của các loại gel khác nhau thường được cung cấp bởi nhà sản xuất.

Ngoài kích thước phân tử, yếu tố nào khác có thể ảnh hưởng đến thời gian lưu trong SEC?

Trả lời: Mặc dù kích thước là yếu tố chủ yếu, nhưng hình dạng phân tử cũng có thể ảnh hưởng đến thời gian lưu. Các phân tử có hình dạng khác nhau nhưng khối lượng phân tử giống nhau có thể tương tác khác nhau với gel, dẫn đến thời gian lưu khác nhau. Ngoài ra, trong một số trường hợp, các tương tác yếu như hấp phụ hoặc phân vùng cũng có thể ảnh hưởng đến thời gian lưu, đặc biệt là đối với các phân tử nhỏ.

Chỉ số đa phân tán (PDI) là gì và nó cung cấp thông tin gì về mẫu polymer?

Trả lời: Chỉ số đa phân tán (PDI) được tính bằng tỷ lệ giữa khối lượng phân tử trung bình trọng lượng ($M_w$) và khối lượng phân tử trung bình số ($M_n$), $PDI = \frac{M_w}{M_n}$. PDI cho biết mức độ đồng nhất của phân bố khối lượng phân tử trong mẫu polymer. Giá trị PDI bằng 1 cho biết mẫu là đơn phân tán, nghĩa là tất cả các chuỗi polymer có cùng khối lượng phân tử. Giá trị PDI lớn hơn 1 cho biết mẫu là đa phân tán, với mức độ phân bố khối lượng phân tử rộng hơn.

Sự khác biệt chính giữa GPC truyền thống và HPSEC là gì?

Trả lời: HPSEC (sắc ký thấm gel hiệu năng cao) sử dụng các hạt gel nhỏ hơn và áp suất cao hơn so với GPC truyền thống. Điều này dẫn đến độ phân giải cao hơn, thời gian phân tích nhanh hơn và hiệu quả phân tách tốt hơn. HPSEC cũng cho phép sử dụng thể tích mẫu nhỏ hơn.

Làm thế nào để hiệu chuẩn cột SEC để xác định khối lượng phân tử của một chất chưa biết?

Trả lời: Hiệu chuẩn cột SEC được thực hiện bằng cách sử dụng một loạt các chất chuẩn có khối lượng phân tử đã biết. Thời gian lưu của mỗi chất chuẩn được đo và vẽ biểu đồ theo logarit của khối lượng phân tử của nó. Đường cong hiệu chuẩn này sau đó được sử dụng để xác định khối lượng phân tử của chất chưa biết dựa trên thời gian lưu của nó.

Một số điều thú vị về Sắc ký lọc gel

“Thấm” hay “Lọc”?: Mặc dù cả hai thuật ngữ “sắc ký lọc gel” và “sắc ký thấm gel” đều được sử dụng, nhưng có một sự khác biệt nhỏ. “Lọc” ngụ ý rằng các phân tử nhỏ bị giữ lại, trong khi “thấm” ngụ ý rằng các phân tử lớn bị loại trừ. Vì cơ chế phân tách dựa trên sự loại trừ kích thước, nên “sắc ký thấm gel” (GPC) về mặt kỹ thuật là thuật ngữ chính xác hơn. Tuy nhiên, cả hai thuật ngữ đều được sử dụng rộng rãi và được coi là đồng nghĩa.
Không chỉ là kích thước: Mặc dù kích thước là yếu tố chính, hình dạng phân tử cũng đóng một vai trò trong SEC. Hai phân tử có cùng khối lượng phân tử nhưng hình dạng khác nhau (ví dụ: một phân tử hình cầu so với một phân tử hình que) có thể có thời gian lưu khác nhau. Phân tử hình que có xu hướng có bán kính thủy động lực học lớn hơn và do đó có thể rửa giải sớm hơn so với phân tử hình cầu.
Kích thước quan trọng, nhưng không phải lúc nào cũng quan trọng: Trong một số trường hợp nhất định, các tương tác yếu khác như hấp phụ hoặc phân vùng có thể ảnh hưởng đến việc phân tách, đặc biệt là với các phân tử nhỏ hơn. Điều này có thể dẫn đến độ phân giải kém hoặc thời gian lưu bất thường.
Từ phòng thí nghiệm đến công nghiệp: SEC được sử dụng rộng rãi trong cả nghiên cứu học thuật và các ứng dụng công nghiệp. Từ việc xác định đặc tính của polymer trong ngành nhựa đến việc tinh chế protein trị liệu trong ngành dược phẩm, SEC đóng một vai trò quan trọng trong nhiều ngành công nghiệp.
Không ngừng phát triển: Nghiên cứu và phát triển liên tục đang được tiến hành để cải thiện hiệu suất của SEC. Các tiến bộ trong công nghệ cột và thiết bị dò đã dẫn đến độ phân giải cao hơn, thời gian phân tích nhanh hơn và phạm vi ứng dụng rộng hơn. Ví dụ, HPSEC (GPC áp suất cao) cung cấp tốc độ và hiệu quả phân tách vượt trội so với GPC truyền thống.