Sắc ký lỏng chân không (Vacuum liquid chromatography (VLC))

Nguyên lý

VLC dựa trên nguyên tắc hấp phụ và phân vùng, tương tự như sắc ký cột cổ điển. Tuy nhiên, thay vì sử dụng trọng lực để di chuyển pha động qua cột tĩnh, VLC sử dụng chân không để tăng tốc độ dòng chảy. Điều này làm giảm đáng kể thời gian phân tách và hạn chế sự khuếch tán dải, dẫn đến việc phân tách hiệu quả hơn. Sự chênh lệch áp suất do chân không tạo ra giúp dung môi di chuyển nhanh hơn qua pha tĩnh, do đó rút ngắn thời gian phân tách. Việc sử dụng chân không cũng cho phép sử dụng các hạt pha tĩnh có kích thước nhỏ hơn, từ đó làm tăng diện tích bề mặt và cải thiện hiệu quả phân tách.

Quy trình

Quy trình thực hiện sắc ký lỏng chân không (VLC) bao gồm các bước sau:

1. Chuẩn bị cột: Một cột sắc ký (thường làm bằng thủy tinh hoặc nhựa) được chọn sao cho phù hợp với lượng mẫu và được bịt kín ở đáy bằng bông thủy tinh hoặc frit thủy tinh. Kích thước cột được lựa chọn dựa trên khối lượng mẫu và độ phức tạp của hỗn hợp.
2. Đóng gói cột: Chất hấp phụ rắn (pha tĩnh), ví dụ như silica gel hoặc alumina, được trộn với dung môi thích hợp và đổ vào cột. Việc tạo huyền phù pha tĩnh với dung môi trước khi đổ vào cột giúp đảm bảo sự phân bố đồng đều và tránh hình thành bọt khí. Sau đó, chân không được áp dụng để loại bỏ dung môi dư thừa và nén chặt pha tĩnh, tạo thành một lớp hấp phụ đồng nhất. Việc đóng gói tốt là rất quan trọng để có được sự phân tách hiệu quả.
3. Nạp mẫu: Mẫu được hòa tan trong một lượng nhỏ dung môi và được nạp cẩn thận lên trên bề mặt chất hấp phụ. Cần đảm bảo mẫu được phân bố đều trên bề mặt pha tĩnh.
4. Rửa giải (Eluting): Dung môi (pha động) được thêm vào cột và chân không được áp dụng để kéo dung môi qua cột. Sức mạnh rửa giải của dung môi được tăng dần bằng cách sử dụng hệ dung môi gradien (từ dung môi không phân cực đến phân cực) để rửa giải các hợp chất khác nhau ra khỏi cột. Các phân đoạn được thu thập riêng biệt.
5. Phân tích và tinh chế: Các phân đoạn thu được được phân tích bằng sắc ký lớp mỏng (TLC) hoặc các phương pháp khác để xác định thành phần của chúng. Các phân đoạn chứa các hợp chất mong muốn được kết hợp và cô đặc.

Ưu và nhược điểm của VLC

Ưu điểm:

• Nhanh chóng và hiệu quả hơn sắc ký cột cổ điển.
• Đơn giản và dễ thực hiện.
• Tiết kiệm chi phí, yêu cầu thiết bị đơn giản.
• Thích hợp cho việc tinh chế lượng lớn mẫu.

Nhược điểm:

• Độ phân giải thấp hơn so với HPLC.
• Khó kiểm soát chính xác tốc độ dòng chảy.
• Có thể gặp khó khăn với các mẫu nhạy cảm với không khí. Nên sử dụng VLC trong điều kiện khí trơ nếu mẫu dễ bị oxy hóa hoặc phân hủy.

So sánh với sắc ký cột cổ điển

Ứng dụng

VLC được sử dụng rộng rãi trong:

• Tinh chế sản phẩm tự nhiên từ thực vật, động vật và vi sinh vật.
• Phân lập các hợp chất tổng hợp hữu cơ.
• Tinh chế các sản phẩm phản ứng.
• Loại bỏ tạp chất khỏi mẫu.

Các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu quả phân tách VLC

Hiệu quả phân tách trong VLC phụ thuộc vào một số yếu tố, bao gồm:

• Lựa chọn chất hấp phụ: Loại và kích thước hạt của chất hấp phụ ảnh hưởng đến khả năng tách các hợp chất. Silica gel là chất hấp phụ phổ biến nhất, được sử dụng cho nhiều loại hợp chất. Alumina cũng được sử dụng, đặc biệt là cho các hợp chất phân cực. Kích thước hạt nhỏ hơn cho độ phân giải tốt hơn nhưng làm tăng áp suất trong cột và có thể làm tắc cột.
• Lựa chọn dung môi: Pha động, hay dung môi, đóng vai trò quan trọng trong VLC. Độ phân cực của dung môi ảnh hưởng đến khả năng rửa giải của các hợp chất. Một gradient dung môi, tức là tăng dần độ phân cực của dung môi trong quá trình rửa giải, thường được sử dụng để tách các hỗn hợp phức tạp.
• Tỷ lệ mẫu/chất hấp phụ: Lượng chất hấp phụ cần sử dụng phụ thuộc vào khối lượng mẫu và độ phức tạp của hỗn hợp. Tỷ lệ mẫu/chất hấp phụ quá cao có thể dẫn đến quá tải cột và giảm hiệu quả phân tách.
• Tốc độ dòng chảy: Tốc độ dòng chảy ảnh hưởng đến thời gian tiếp xúc giữa mẫu và chất hấp phụ. Tốc độ dòng chảy quá nhanh có thể làm giảm hiệu quả phân tách, trong khi tốc độ dòng chảy quá chậm có thể dẫn đến sự khuếch tán dải. Tốc độ dòng chảy tối ưu được xác định bằng thực nghiệm.
• Đóng gói cột: Đóng gói cột chặt và đồng nhất là rất quan trọng để có được sự phân tách hiệu quả. Cột được đóng gói lỏng lẻo có thể dẫn đến sự hình thành các kênh ưu tiên và giảm hiệu quả phân tách.

Kỹ thuật VLC đặc biệt

Ngoài VLC cổ điển, một số kỹ thuật VLC đặc biệt đã được phát triển cho các ứng dụng cụ thể:

• Dry Column Vacuum Chromatography (DCVC): Kỹ thuật này sử dụng cột khô được đóng gói với chất hấp phụ khô. Mẫu được nạp lên trên cột, sau đó được rửa giải bằng dung môi. DCVC đặc biệt hữu ích cho các mẫu nhạy cảm với độ ẩm.
• Flash Chromatography: Đây là một phiên bản VLC được cải tiến sử dụng áp suất không khí hoặc nitơ để tăng tốc độ dòng chảy và cải thiện hiệu quả phân tách. Flash chromatography thường sử dụng cột silica gel được đóng gói sẵn và bơm dung môi với áp suất được kiểm soát.

So sánh VLC với các kỹ thuật sắc ký khác

VLC có nhiều ưu điểm so với các kỹ thuật sắc ký khác, nhưng cũng có một số hạn chế. Bảng dưới đây so sánh VLC với một số kỹ thuật sắc ký khác: