Tế bào lai (Hybridoma)

Cơ chế hình thành

• Tế bào Lympho B: Sau khi được miễn dịch với một kháng nguyên đặc hiệu, tế bào lympho B sẽ sản xuất kháng thể chống lại kháng nguyên đó. Tuy nhiên, các tế bào lympho B bình thường có tuổi thọ hạn chế trong nuôi cấy in vitro.
• Tế bào Myeloma: Đây là dòng tế bào ung thư tủy xương có khả năng sinh trưởng vô hạn trong nuôi cấy. Tuy nhiên, chúng không sản xuất kháng thể mong muốn.
• Dung hợp tế bào: Hai loại tế bào này được dung hợp bằng cách sử dụng các chất như polyethylene glycol (PEG) hoặc virus Sendai. PEG làm mất ổn định màng tế bào, cho phép hai tế bào hợp nhất lại thành một tế bào lai chứa bộ nhiễm sắc thể của cả hai tế bào gốc. Một số phương pháp khác như điện dung hợp cũng có thể được sử dụng.
• Chọn lọc: Sau quá trình dung hợp, cần chọn lọc những tế bào lai thành công. Điều này được thực hiện bằng cách sử dụng môi trường chọn lọc, thường là môi trường HAT (hypoxanthine-aminopterin-thymidine). Môi trường này chỉ cho phép tế bào lai sống sót, trong khi tế bào lympho B và myeloma không dung hợp sẽ chết. Nguyên lý là tế bào myeloma bị đột biến mất enzyme cần thiết cho một con đường sinh tổng hợp nucleotide nhất định (con đường cứu vớt), trong khi tế bào lympho B thì không. Aminopterin trong môi trường HAT ức chế con đường sinh tổng hợp nucleotide chung (con đường de novo), vì vậy chỉ tế bào lai có cả enzyme từ lympho B (cho phép sử dụng con đường cứu vớt) và khả năng tăng sinh vô hạn từ tế bào myeloma mới có thể sống sót. Hypoxanthine và thymidine trong môi trường HAT cung cấp nguyên liệu cho con đường cứu vớt.

Ứng dụng

Tế bào lai và kháng thể đơn dòng mà chúng sản xuất có nhiều ứng dụng quan trọng trong nghiên cứu y sinh và điều trị bệnh:

• Chẩn đoán: Kháng thể đơn dòng được sử dụng trong các xét nghiệm chẩn đoán để phát hiện các dấu ấn sinh học của bệnh, ví dụ như trong xét nghiệm ELISA, xét nghiệm dòng chảy, và các kỹ thuật miễn dịch học khác.
• Điều trị: Kháng thể đơn dòng được sử dụng để điều trị nhiều bệnh, bao gồm ung thư, bệnh tự miễn và bệnh truyền nhiễm. Chúng có thể nhắm mục tiêu vào các tế bào ung thư, các phân tử cụ thể liên quan đến bệnh, hoặc các thụ thể trên bề mặt tế bào miễn dịch để điều chỉnh đáp ứng miễn dịch.
• Nghiên cứu: Kháng thể đơn dòng là công cụ quan trọng trong nghiên cứu cơ bản để nghiên cứu các protein, các quá trình tế bào, và xác định các dấu ấn sinh học mới.

Ưu điểm của kháng thể đơn dòng

• Tính đặc hiệu cao: Nhắm mục tiêu chính xác vào kháng nguyên mong muốn, giảm thiểu tác dụng phụ.
• Đồng nhất: Tất cả các kháng thể đều giống nhau về cấu trúc và tính đặc hiệu, đảm bảo tính nhất quán trong kết quả nghiên cứu và điều trị.
• Sản xuất với số lượng lớn: Tế bào lai có thể được nuôi cấy để sản xuất một lượng lớn kháng thể, đáp ứng nhu cầu nghiên cứu và điều trị.

Hạn chế

• Khó sản xuất: Quá trình tạo tế bào lai và chọn lọc có thể phức tạp, tốn thời gian và chi phí cao.
• Khả năng gây miễn dịch: Vì kháng thể đơn dòng thường được tạo ra từ chuột (kháng thể chuột), chúng có thể gây ra phản ứng miễn dịch ở người (phản ứng kháng kháng thể chuột – HAMA). Hiện nay, các kỹ thuật di truyền tái tổ hợp đã được sử dụng để tạo ra các kháng thể đơn dòng nhân bản hóa (chimeric), nhân bản hóa (humanized) và hoàn toàn người (fully human) để giảm thiểu khả năng gây miễn dịch.
• Độ ổn định: Kháng thể đơn dòng có thể bị biến tính hoặc mất hoạt tính trong quá trình bảo quản hoặc vận chuyển.

Tế bào lai là một công cụ mạnh mẽ trong công nghệ sinh học, cho phép sản xuất kháng thể đơn dòng với tính đặc hiệu cao và ứng dụng rộng rãi trong chẩn đoán, điều trị và nghiên cứu.

Các phương pháp tạo tế bào lai

Mặc dù phương pháp sử dụng PEG là phổ biến nhất, còn có một số phương pháp khác để tạo tế bào lai:

• Điện dung hợp: Sử dụng xung điện ngắn để tạo lỗ trên màng tế bào, cho phép hai tế bào hợp nhất. Phương pháp này có thể hiệu quả hơn PEG trong một số trường hợp và ít độc hại hơn cho tế bào.
• Virus Sendai: Virus bất hoạt được sử dụng để thúc đẩy sự hợp nhất của tế bào. Tuy nhiên, phương pháp này ít được sử dụng hơn hiện nay do lo ngại về an toàn sinh học.
• Laser dung hợp: Sử dụng laser để tạo ra các lỗ nhỏ trên màng tế bào, cho phép hai tế bào dung hợp. Phương pháp này cho phép kiểm soát chính xác hơn quá trình dung hợp nhưng đòi hỏi thiết bị chuyên dụng.

Cải tiến trong công nghệ tế bào lai

Nghiên cứu đang được tiến hành để cải thiện công nghệ tế bào lai và khắc phục những hạn chế hiện tại. Một số hướng nghiên cứu bao gồm:

• Tạo tế bào lai người: Nhằm giảm thiểu phản ứng miễn dịch ở người, các nhà khoa học đang nghiên cứu tạo ra tế bào lai từ tế bào người. Điều này có thể đạt được bằng cách sử dụng tế bào myeloma người hoặc bằng cách “nhân bản hóa” kháng thể chuột.
• Kỹ thuật hiển thị phage (phage display): Kỹ thuật này cho phép tạo ra các kháng thể đơn dòng với tính đặc hiệu cao mà không cần sử dụng tế bào lai. Thư viện phage hiển thị các đoạn kháng thể khác nhau trên bề mặt, và các phage mang kháng thể đặc hiệu với kháng nguyên đích có thể được chọn lọc và nhân lên.
• Kháng thể tái tổ hợp: Các kháng thể được sản xuất bằng kỹ thuật di truyền có thể được thiết kế với các đặc tính mong muốn, chẳng hạn như tăng ái lực, giảm khả năng gây miễn dịch, hoặc các chức năng mới.

Các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu quả tạo tế bào lai

• Tỷ lệ tế bào lympho B và myeloma: Tỷ lệ tối ưu cần được xác định cho từng thí nghiệm. Thông thường, tỷ lệ lympho B : myeloma từ 1:1 đến 10:1 được sử dụng.
• Nồng độ và thời gian tiếp xúc với chất dung hợp: Điều kiện tối ưu cần được xác định cho từng loại chất dung hợp. Ví dụ, nồng độ PEG và thời gian tiếp xúc cần được tối ưu hóa để đạt hiệu quả dung hợp cao nhất mà không gây độc hại quá mức cho tế bào.
• Môi trường nuôi cấy: Môi trường nuôi cấy phù hợp là cần thiết cho sự tăng trưởng và sản xuất kháng thể của tế bào lai. Môi trường HAT được sử dụng để chọn lọc tế bào lai, và sau đó, các môi trường nuôi cấy khác có thể được sử dụng để duy trì và nhân dòng tế bào lai.
• Nguồn và chất lượng tế bào lympho B: Lympho B được phân lập từ động vật được miễn dịch hoặc từ người. Chất lượng và số lượng lympho B ảnh hưởng đáng kể đến hiệu quả tạo tế bào lai.

• Köhler, G., & Milstein, C. (1975). Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity. Nature, 256(5517), 495–497.
• Goding, J. W. (1996). Monoclonal antibodies: principles and practice. Academic press.
• Harlow, E., & Lane, D. (1988). Antibodies: a laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory.

Câu hỏi và Giải đáp

Ngoài PEG, còn những phương pháp nào khác để dung hợp tế bào lympho B và tế bào myeloma, và ưu nhược điểm của chúng là gì?

Trả lời: Ngoài Polyethylene Glycol (PEG), còn có các phương pháp dung hợp tế bào khác như điện dung hợp (electrofusion) và sử dụng virus Sendai bất hoạt. Điện dung hợp sử dụng xung điện ngắn để tạo lỗ trên màng tế bào, giúp tăng hiệu quả dung hợp và giảm độc tính so với PEG. Tuy nhiên, thiết bị cho điện dung hợp khá đắt tiền. Virus Sendai thúc đẩy sự hợp nhất màng tế bào, nhưng phương pháp này ít được sử dụng do lo ngại về an toàn sinh học và hiệu quả không ổn định.

Tại sao môi trường HAT lại cần thiết trong quy trình tạo tế bào lai và cơ chế hoạt động của nó là gì?

Trả lời: Môi trường HAT (Hypoxanthine-Aminopterin-Thymidine) là môi trường chọn lọc quan trọng. Aminopterin ức chế con đường sinh tổng hợp nucleotide de novo. Tế bào myeloma được sử dụng thường bị khuyết tật ở con đường “giải cứu” nucleotide, nghĩa là chúng không thể sử dụng hypoxanthine và thymidine để tổng hợp nucleotide khi con đường de novo bị chặn. Tế bào lympho B bình thường có con đường “giải cứu” nucleotide hoạt động. Trong môi trường HAT, chỉ tế bào lai (mang cả khả năng sinh trưởng liên tục của myeloma và enzyme hoạt động của con đường “giải cứu” từ lympho B) mới có thể tổng hợp nucleotide và sống sót.

Kháng thể “chimeric” và kháng thể “humanized” là gì, và chúng khác với kháng thể đơn dòng chuột như thế nào?

Trả lời: Kháng thể đơn dòng chuột có thể gây ra phản ứng miễn dịch ở người. Để giảm thiểu điều này, người ta đã phát triển kháng thể “chimeric” và “humanized”. Kháng thể “chimeric” là kháng thể lai, trong đó vùng biến đổi (V) của kháng thể chuột được ghép với vùng hằng định (C) của kháng thể người. Kháng thể “humanized” chỉ giữ lại các phần nhỏ của vùng biến đổi chuột (CDRs – Complementarity Determining Regions) ghép vào khung kháng thể người. Kháng thể “humanized” ít gây miễn dịch hơn kháng thể “chimeric” và kháng thể chuột.

Ngoài ứng dụng trong y sinh, kháng thể đơn dòng còn được sử dụng trong lĩnh vực nào khác?

Trả lời: Kháng thể đơn dòng còn được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực khác như nông nghiệp (phát hiện mầm bệnh thực vật), công nghiệp thực phẩm (kiểm soát chất lượng) và khoa học môi trường (phát hiện chất ô nhiễm).

Những thách thức nào cần vượt qua để phát triển tế bào lai người hiệu quả và ứng dụng rộng rãi trong điều trị?

Trả lời: Việc tạo tế bào lai người gặp nhiều khó khăn hơn so với tế bào lai chuột, bao gồm hiệu suất dung hợp thấp, khó khăn trong việc duy trì sự phát triển ổn định của tế bào lai và sản lượng kháng thể thấp. Nghiên cứu đang tập trung vào việc tối ưu hóa các điều kiện nuôi cấy và phát triển các dòng tế bào myeloma người phù hợp hơn để dung hợp. Một thách thức khác là đảm bảo tính an toàn và hiệu quả của kháng thể đơn dòng người trong điều trị lâm sàng.