Tổng hợp oligonucleotide (Oligonucleotide synthesis)

Phương pháp tổng hợp

Phương pháp phổ biến nhất để tổng hợp oligonucleotide là tổng hợp phosphoramidite, được thực hiện theo kiểu tăng bậc trên giá đỡ rắn. Quá trình này diễn ra theo hướng 3′ đến 5′ và bao gồm các bước sau:

1. Khởi đầu: Một nucleoside đầu tiên được gắn vào giá đỡ rắn thông qua liên kết cộng hóa trị. Nhóm 5′-hydroxyl của nucleoside này được bảo vệ bằng nhóm bảo vệ DMT (dimethoxytrityl).
2. Khử bảo vệ (Detritylation): Nhóm DMT được loại bỏ bằng dung dịch axit, tạo ra nhóm 5′-hydroxyl tự do để phản ứng với nucleoside tiếp theo.
3. Cặp đôi (Coupling): Một nucleoside phosphoramidite được hoạt hóa được thêm vào, phản ứng với nhóm 5′-hydroxyl tự do để tạo thành liên kết phosphite triester. Nucleoside phosphoramidite cũng được bảo vệ ở các vị trí phản ứng khác để ngăn chặn các phản ứng phụ.
4. Oxy hóa (Oxidation): Liên kết phosphite triester không ổn định được oxy hóa thành liên kết phosphodiester ổn định hơn bằng dung dịch iodine.
5. Capping (Bịt kín): Bất kỳ nhóm 5′-hydroxyl nào chưa phản ứng được bịt kín bằng anhydrit axetic để ngăn chặn sự kéo dài thêm ở các chuỗi này trong các chu kỳ tiếp theo. Điều này đảm bảo rằng chỉ có các chuỗi dài mong muốn được tổng hợp.
6. Lặp lại bước 2-5: Các bước 2 đến 5 được lặp lại cho mỗi nucleoside trong chuỗi oligonucleotide mong muốn.
7. Khử bảo vệ và phân cắt: Sau khi tổng hợp hoàn tất, tất cả các nhóm bảo vệ được loại bỏ và oligonucleotide được phân cắt khỏi giá đỡ rắn. Sau đó, oligonucleotide thô được tinh sạch để loại bỏ các sản phẩm phụ và các chuỗi ngắn, thường bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) hoặc điện di.

Công thức hóa học

Phản ứng ghép cặp (Coupling) có thể được biểu diễn đơn giản như sau:

5′-HO-DNA + Nucleoside-Phosphoramidite → 5′-O-P(OR)-O-DNA (R là nhóm bảo vệ)

Sau đó phản ứng oxy hóa:

5′-O-P(OR)-O-DNA + I₂ → 5′-O-P(O)₂-O-DNA

Ưu điểm của tổng hợp phosphoramidite

• Hiệu suất cao và tốc độ phản ứng nhanh.
• Tự động hóa dễ dàng. Điều này cho phép tổng hợp oligonucleotide quy mô lớn một cách nhanh chóng và hiệu quả.
• Khả năng tổng hợp oligonucleotide dài với độ chính xác cao. Mặc dù hiệu suất giảm nhẹ theo chiều dài, phương pháp này vẫn cho phép tổng hợp các chuỗi dài hơn 100 nucleotide.

Ứng dụng

Tổng hợp oligonucleotide có rất nhiều ứng dụng trong các lĩnh vực khác nhau:

• Nghiên cứu sinh học phân tử: PCR, giải trình tự DNA, lai tại chỗ, đột biến định hướng. Oligonucleotide được sử dụng làm mồi PCR, đầu dò lai và trong nhiều kỹ thuật sinh học phân tử khác.
• Chẩn đoán: phát hiện mầm bệnh, phân tích di truyền. Các oligonucleotide đặc hiệu có thể được sử dụng để phát hiện sự hiện diện của các trình tự DNA hoặc RNA cụ thể, ví dụ như trong xét nghiệm chẩn đoán các bệnh truyền nhiễm.
• Liệu pháp: liệu pháp antisense, liệu pháp gen, vắc-xin DNA. Oligonucleotide antisense có thể ức chế biểu hiện gen, trong khi oligonucleotide được sử dụng trong liệu pháp gen và vắc-xin.
• Công nghệ nano: xây dựng các cấu trúc DNA nano. Oligonucleotide có thể được thiết kế để tự lắp ráp thành các cấu trúc nano phức tạp với các ứng dụng tiềm năng trong khoa học vật liệu và y học.

Tổng hợp oligonucleotide là một công nghệ quan trọng trong sinh học hiện đại, cho phép tổng hợp các đoạn DNA và RNA tùy chỉnh với độ chính xác cao. Phương pháp tổng hợp phosphoramidite đã cách mạng hóa lĩnh vực này và mở ra nhiều ứng dụng tiềm năng trong nghiên cứu, chẩn đoán và liệu pháp.

Các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu suất tổng hợp

Hiệu suất tổng hợp oligonucleotide bị ảnh hưởng bởi một số yếu tố, bao gồm:

• Chiều dài oligonucleotide: Oligonucleotide dài hơn thường có hiệu suất tổng hợp thấp hơn do sự tích lũy các phản ứng phụ và sự phân cắt không hoàn toàn. Mỗi chu kỳ bổ sung nucleotit đều có khả năng xảy ra lỗi, do đó làm giảm hiệu suất tổng hợp tổng thể.
• Trình tự DNA: Một số trình tự nhất định, chẳng hạn như các vùng giàu GC, có thể khó tổng hợp hơn do sự hình thành cấu trúc thứ cấp. Các vùng này có thể tạo thành cấu trúc kẹp tóc hoặc các cấu trúc ổn định khác cản trở quá trình tổng hợp.
• Chất lượng thuốc thử: Độ tinh khiết của phosphoramidite và các thuốc thử khác đóng vai trò quan trọng trong việc đạt được hiệu suất tổng hợp cao. Các tạp chất có thể cản trở phản ứng hoặc dẫn đến các sản phẩm phụ không mong muốn.
• Điều kiện phản ứng: Các thông số phản ứng như nhiệt độ, thời gian và nồng độ thuốc thử cần được tối ưu hóa để đảm bảo hiệu suất tối đa.

Các phương pháp tinh sạch oligonucleotide

Sau khi tổng hợp, oligonucleotide thường được tinh sạch để loại bỏ các sản phẩm phụ và thuốc thử chưa phản ứng. Các phương pháp tinh sạch phổ biến bao gồm:

• Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC): HPLC là một kỹ thuật mạnh mẽ cho phép tách các oligonucleotide dựa trên kích thước, điện tích hoặc ái lực. Sắc ký pha đảo ngược (RP-HPLC) thường được sử dụng để tinh sạch oligonucleotide.
• Điện di trên gel polyacrylamide (PAGE): PAGE là một phương pháp đơn giản và hiệu quả để tinh sạch oligonucleotide dựa trên kích thước. Phương pháp này đặc biệt hữu ích cho việc tinh sạch oligonucleotide ngắn.
• Tinh sạch bằng cartridge: Sử dụng các cartridge chứa các pha tĩnh đặc biệt để liên kết chọn lọc với oligonucleotide. Đây là một phương pháp tinh sạch nhanh chóng và thuận tiện.

Các biến thể của tổng hợp phosphoramidite

Bên cạnh phương pháp phosphoramidite truyền thống, một số biến thể đã được phát triển để cải thiện hiệu suất và mở rộng ứng dụng của tổng hợp oligonucleotide:

• Tổng hợp oligonucleotide quy mô lớn: Cho phép sản xuất số lượng lớn oligonucleotide cho các ứng dụng thương mại.
• Tổng hợp oligonucleotide in situ: Tổng hợp oligonucleotide trực tiếp trên chip hoặc các bề mặt khác. Điều này có ứng dụng trong sản xuất microarray và các thiết bị khác.
• Tổng hợp oligonucleotide sử dụng phosphoramidite biến đổi: Cho phép tổng hợp oligonucleotide với các sửa đổi hóa học đặc biệt, ví dụ như oligonucleotide gắn nhãn huỳnh quang hoặc biotin. Những sửa đổi này có thể được sử dụng cho nhiều ứng dụng, bao gồm hình ảnh và phát hiện.

Ví dụ về ứng dụng trong liệu pháp antisense

Liệu pháp antisense sử dụng oligonucleotide tổng hợp để ức chế biểu hiện gen. Một ví dụ là mipomersen, một oligonucleotide antisense được sử dụng để điều trị tăng cholesterol máu gia đình đồng hợp tử. Mipomersen liên kết với mRNA mã hóa apolipoprotein B-100, ngăn chặn sự dịch mã và do đó làm giảm sản xuất lipoprotein tỷ trọng thấp (LDL). Đây là một ví dụ về cách oligonucleotide tổng hợp có thể được sử dụng để nhắm mục tiêu các gen cụ thể cho mục đích điều trị.

• Beaucage, S. L., & Caruthers, M. H. (1981). Deoxynucleoside phosphoramidites—A new class of key intermediates for deoxypolynucleotide synthesis. Tetrahedron Letters, 22(18), 1859-1862.
• Blackburn, G. M., & Gait, M. J. (Eds.). (1996). Nucleic acids in chemistry and biology. Oxford University Press.
• Herdewijn, P. (Ed.). (2005). Oligonucleotide synthesis: methods and applications. Humana Press.

Câu hỏi và Giải đáp

Ngoài phương pháp phosphoramidite, còn có phương pháp nào khác được sử dụng để tổng hợp oligonucleotide không? Ưu điểm và nhược điểm của chúng là gì?

Trả lời: Có một số phương pháp tổng hợp oligonucleotide khác, bao gồm phương pháp H-phosphonate và phương pháp phosphotriester. Tuy nhiên, phương pháp phosphoramidite hiện là phương pháp phổ biến nhất do hiệu suất cao, tự động hóa dễ dàng và khả năng tổng hợp oligonucleotide dài. Phương pháp H-phosphonate có ưu điểm là không cần bước oxy hóa, nhưng lại nhạy cảm với oxy. Phương pháp phosphotriester, mặc dù được sử dụng rộng rãi trước đây, nhưng kém hiệu quả hơn so với phosphoramidite.

Làm thế nào để thiết kế một oligonucleotide antisense hiệu quả? Những yếu tố nào cần được xem xét?

Trả lời: Thiết kế oligonucleotide antisense hiệu quả cần xem xét nhiều yếu tố, bao gồm:

• Tính đặc hiệu: Oligonucleotide cần liên kết đặc hiệu với mRNA đích để tránh các tác dụng ngoài ý muốn.
• Độ ổn định: Oligonucleotide cần có khả năng chống lại sự phân hủy bởi các nuclease trong tế bào. Các sửa đổi hóa học, chẳng hạn như phosphorothioate, có thể được sử dụng để tăng cường tính ổn định.
• Khả năng xâm nhập tế bào: Oligonucleotide cần có thể xâm nhập vào tế bào đích để phát huy tác dụng. Các chất mang, chẳng hạn như lipid, có thể được sử dụng để hỗ trợ quá trình xâm nhập tế bào.
• Tính độc hại: Oligonucleotide không được gây độc cho tế bào.

Nhóm bảo vệ DMT đóng vai trò gì trong tổng hợp oligonucleotide theo phương pháp phosphoramidite?

Trả lời: Nhóm bảo vệ DMT (4,4′-Dimethoxytrityl) bảo vệ nhóm 5′-hydroxyl của nucleoside. Nó được loại bỏ chọn lọc trong mỗi chu kỳ tổng hợp để cho phép sự ghép cặp với nucleoside phosphoramidite tiếp theo. Sự hiện diện hoặc vắng mặt của nhóm DMT cũng được sử dụng để theo dõi hiệu suất của phản ứng ghép cặp.

Tại sao liên kết phosphite triester được tạo thành trong bước ghép cặp cần phải được oxy hóa thành liên kết phosphodiester?

Trả lời: Liên kết phosphite triester (P(III)) không ổn định trong điều kiện sinh lý và dễ bị thủy phân. Oxy hóa thành liên kết phosphodiester (P(V)) tạo ra một liên kết ổn định hơn, giống với liên kết tự nhiên trong DNA và RNA.

Ngoài các ứng dụng đã đề cập, tổng hợp oligonucleotide còn có những ứng dụng tiềm năng nào khác trong tương lai?

Trả lời: Tổng hợp oligonucleotide có tiềm năng lớn trong nhiều lĩnh vực, bao gồm:

• Phát triển các liệu pháp gen mới: Oligonucleotide có thể được sử dụng để sửa chữa các đột biến gen hoặc điều chỉnh biểu hiện gen.
• Tạo ra các vật liệu nano DNA: Oligonucleotide có thể được sử dụng để xây dựng các cấu trúc nano phức tạp với các ứng dụng trong điện tử, cảm biến và phân phối thuốc.
• Phát triển các công cụ chẩn đoán mới: Oligonucleotide có thể được sử dụng để phát hiện các dấu ấn sinh học của bệnh hoặc theo dõi đáp ứng điều trị.
• Nghiên cứu cơ bản về cấu trúc và chức năng của axit nucleic: Oligonucleotide tổng hợp cung cấp một công cụ mạnh mẽ để nghiên cứu các quá trình sinh học liên quan đến DNA và RNA.