Xác định cấu trúc bằng phổ khối (Mass spectrometry structure determination/MS structure elucidation)

Nguyên lý

Phân tử mẫu được ion hóa trong nguồn ion của máy khối phổ. Quá trình ion hóa này có thể tạo ra ion phân tử (molecular ion, $M^{+\cdot}$ hoặc $M^{-}$) và các ion mảnh (fragment ions). Các ion này sau đó được phân tách theo tỉ lệ m/z và được ghi lại thành phổ khối.

Phổ khối cung cấp thông tin về:

• Khối lượng phân tử: Đỉnh ion phân tử ($M^{+\cdot}$ hoặc $M^{-}$) cho biết khối lượng phân tử của hợp chất.
• Công thức phân tử: Khối lượng chính xác của ion phân tử có thể được sử dụng để xác định công thức phân tử. Sự phân bố đồng vị (isotopic distribution) cũng cung cấp thông tin hữu ích về thành phần nguyên tố.
• Cấu trúc phân tử: Các ion mảnh được tạo ra do sự phân rã của ion phân tử. Kiểu phân mảnh này phụ thuộc vào cấu trúc của phân tử và cung cấp manh mối quan trọng về các nhóm chức và sự liên kết của các nguyên tử trong phân tử. Việc phân tích các kiểu phân mảnh này, kết hợp với các thông tin khác từ phổ khối (ví dụ: sự mất nước, mất các nhóm methyl, v.v.) giúp ta suy luận về cấu trúc của phân tử.

Các kỹ thuật ion hóa thường dùng

Việc lựa chọn kỹ thuật ion hóa phù hợp phụ thuộc vào tính chất của phân tử cần phân tích và loại thông tin mong muốn. Một số kỹ thuật ion hóa thường dùng bao gồm:

• Ion hóa điện tử (Electron Ionization – EI): Phương pháp này sử dụng chùm electron năng lượng cao (thường là 70 eV) để ion hóa phân tử. EI thường tạo ra nhiều ion mảnh, hữu ích cho việc xác định cấu trúc bằng cách phân tích các kiểu phân mảnh đặc trưng. Tuy nhiên, EI cũng có thể gây ra sự phân mảnh mạnh, đôi khi làm mất đỉnh ion phân tử.
• Ion hóa hóa học (Chemical Ionization – CI): Phương pháp này sử dụng một chất khí phản ứng (ví dụ: metan, amoniac) để ion hóa phân tử. CI tạo ra ít ion mảnh hơn EI và thường tạo ra ion phân tử $[M+H]^{+}$ hoặc $[M-H]^{-}$, giúp xác định khối lượng phân tử dễ dàng hơn.
• Electrospray Ionization (ESI): Phương pháp ion hóa mềm thường được sử dụng cho các phân tử lớn và phân cực. ESI tạo ra các ion đa điện tích, giúp phân tích các phân tử có khối lượng lớn. Phương pháp này đặc biệt hữu ích trong việc phân tích protein, peptide và các phân tử sinh học khác.
• Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization (MALDI): Phương pháp ion hóa mềm khác, thường được sử dụng cho các phân tử lớn như protein và polymer. Trong MALDI, mẫu được trộn với một chất nền (matrix) và sau đó được chiếu xạ bằng tia laser.

Phân tích phổ khối

Việc phân tích phổ khối liên quan đến việc giải thích các đỉnh trong phổ, xác định ion phân tử và các ion mảnh quan trọng. Các quy tắc phân mảnh (fragmentation rules) có thể được sử dụng để dự đoán các ion mảnh có thể hình thành từ các loại cấu trúc phân tử khác nhau. Phần mềm máy tính và cơ sở dữ liệu phổ khối có thể hỗ trợ quá trình phân tích này. Việc so sánh phổ thu được với các phổ trong thư viện cũng là một phương pháp hữu ích để xác định các hợp chất đã biết.

Kết hợp với các kỹ thuật khác

Thông tin từ phổ khối thường được kết hợp với các dữ liệu từ các kỹ thuật phân tích khác như phổ NMR, phổ IR và sắc ký để xác định cấu trúc hoàn chỉnh của phân tử. Sự kết hợp này cho phép tận dụng điểm mạnh của từng kỹ thuật, cung cấp một bức tranh toàn diện về cấu trúc phân tử. Ví dụ, phổ NMR cung cấp thông tin về môi trường hóa học của các nguyên tử trong phân tử, trong khi phổ IR cho biết sự hiện diện của các nhóm chức.

Ứng dụng

Xác định cấu trúc bằng phổ khối được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực, bao gồm:

• Hóa học hữu cơ: Xác định cấu trúc của các hợp chất tổng hợp mới.
• Hóa sinh: Phân tích protein, peptide và các phân tử sinh học khác.
• Khoa học môi trường: Xác định các chất ô nhiễm trong môi trường.
• Dược phẩm: Phát triển và kiểm soát chất lượng thuốc.
• Khoa học vật liệu: Phân tích thành phần và cấu trúc của vật liệu.
• Thực phẩm và đồ uống: Kiểm tra chất lượng và an toàn thực phẩm.

Các loại máy khối phổ

Có nhiều loại máy khối phổ khác nhau, mỗi loại được thiết kế cho các ứng dụng cụ thể. Việc lựa chọn loại máy khối phổ phù hợp phụ thuộc vào yêu cầu phân tích, chẳng hạn như độ phân giải khối lượng, độ nhạy và phạm vi khối lượng. Một số loại phổ biến bao gồm:

• Khối phổ tứ cực (Quadrupole mass spectrometer): Sử dụng bốn thanh kim loại song song để lọc các ion theo tỉ lệ m/z. Loại máy này có kích thước nhỏ gọn, giá thành phải chăng và thường được sử dụng trong các ứng dụng phân tích thông thường.
• Khối phổ bẫy ion (Ion trap mass spectrometer): Bẫy và phân tích các ion trong một trường điện từ ba chiều. Cung cấp độ nhạy cao và khả năng phân mảnh MS/MS.
• Khối phổ thời gian bay (Time-of-flight mass spectrometer – TOF-MS): Đo thời gian các ion bay qua một khoảng cách nhất định để xác định tỉ lệ m/z. TOF-MS có độ phân giải khối lượng cao và có thể phân tích các phân tử có khối lượng lớn.
• Khối phổ cộng hưởng cyclotron ion biến đổi Fourier (Fourier transform ion cyclotron resonance mass spectrometer – FT-ICR MS): Đo tần số cyclotron của các ion trong một từ trường mạnh để xác định tỉ lệ m/z với độ chính xác rất cao.

Phân mảnh MS/MS (Tandem Mass Spectrometry)

Kỹ thuật MS/MS liên quan đến việc phân tách và phân mảnh các ion đã được chọn lọc. Phương pháp này cung cấp thông tin cấu trúc chi tiết hơn bằng cách phân tích các ion mảnh của một ion tiền chất (precursor ion) cụ thể. Các loại máy khối phổ như bẫy ion và tứ cực ba có thể thực hiện phân mảnh MS/MS.

Giải thích phổ khối

Việc giải thích phổ khối đòi hỏi kiến thức về hóa học hữu cơ, các quy tắc phân mảnh và kinh nghiệm. Một số quy tắc phân mảnh phổ biến bao gồm:

• Quy tắc nitơ (Nitrogen rule): Hợp chất hữu cơ chứa một số lẻ nguyên tử nitơ sẽ có khối lượng phân tử lẻ.
• Mất nước ($H_2O$): Các hợp chất chứa nhóm hydroxyl (-OH) thường mất một phân tử nước (m/z 18) trong quá trình phân mảnh.
• Phân mảnh McLafferty: Xảy ra trong các xeton và este, dẫn đến sự hình thành các ion mảnh đặc trưng.

Phần mềm và cơ sở dữ liệu

Có nhiều phần mềm và cơ sở dữ liệu có sẵn để hỗ trợ việc giải thích phổ khối. Các phần mềm này có thể giúp xác định công thức phân tử, dự đoán các ion mảnh và so sánh phổ khối với các phổ trong cơ sở dữ liệu. Một số cơ sở dữ liệu phổ khối phổ biến bao gồm NIST Mass Spectral Library và Wiley Registry of Mass Spectral Data.

Thách thức và hạn chế

Mặc dù xác định cấu trúc bằng phổ khối là một kỹ thuật mạnh mẽ, nhưng nó cũng có một số hạn chế. Ví dụ, một số phân tử có thể không tạo ra ion phân tử hoặc tạo ra các phổ phức tạp khó giải thích. Ngoài ra, phổ khối không cung cấp thông tin trực tiếp về cấu trúc không gian ba chiều của phân tử. Đối với các phân tử đồng phân, phổ khối có thể giống nhau, gây khó khăn cho việc phân biệt chúng. Việc kết hợp phổ khối với các kỹ thuật phân tích khác là cần thiết để khắc phục những hạn chế này.

• Silverstein, R. M.; Webster, F. X.; Kiemle, D. J. Spectrometric Identification of Organic Compounds, 7th ed.; John Wiley & Sons: Hoboken, NJ, 2005.
• McLafferty, F. W.; Tureček, F. Interpretation of Mass Spectra, 4th ed.; University Science Books: Sausalito, CA, 1990.
• Gross, J. H. Mass Spectrometry: A Textbook, 3rd ed.; Springer: Heidelberg, 2017.
• Hoffman, E. d.; Stroobant, V. Mass Spectrometry: Principles and Applications, 3rd ed.; John Wiley & Sons: Chichester, 2007.

Câu hỏi và Giải đáp

Làm thế nào để phân biệt giữa ion phân tử $M^{+\cdot}$ và ion $[M+H]^+$ trong phổ khối?

Trả lời: Ion phân tử $M^{+\cdot}$ được hình thành do sự mất một electron từ phân tử trung hòa, trong khi ion $[M+H]^+$ được hình thành do sự gắn thêm một proton (H+) vào phân tử trung hòa. Sự khác biệt về khối lượng giữa hai ion này là 1 Da. Trong phổ khối EI, thường quan sát thấy ion phân tử $M^{+\cdot}$, trong khi trong phổ khối CI hay ESI, ion $[M+H]^+$ thường phổ biến hơn. Quan sát kỹ mẫu phân bố đồng vị cũng có thể giúp phân biệt hai loại ion này.

Quy tắc nitơ (Nitrogen rule) có luôn luôn đúng không? Có ngoại lệ nào không?

Trả lời: Quy tắc nitơ nói rằng một hợp chất hữu cơ chứa một số lẻ nguyên tử nitơ sẽ có khối lượng phân tử lẻ. Quy tắc này thường đúng, nhưng có một số ngoại lệ. Ví dụ, các hợp chất chứa các nguyên tố có nhiều đồng vị ổn định với số khối lẻ (như clo và brom) có thể vi phạm quy tắc này.

Kỹ thuật MS/MS (Tandem Mass Spectrometry) hữu ích như thế nào trong việc xác định cấu trúc?

Trả lời: MS/MS cho phép phân tích các ion mảnh của một ion tiền chất (precursor ion) đã được chọn lọc. Bằng cách phân mảnh ion tiền chất và phân tích các ion mảnh tạo thành, ta có thể thu được thông tin cấu trúc chi tiết hơn về phân tử ban đầu. Điều này đặc biệt hữu ích khi phổ khối ban đầu quá phức tạp hoặc khi cần xác định vị trí của các nhóm chức cụ thể trong phân tử.

Ngoài phổ NMR và phổ IR, còn có kỹ thuật nào khác có thể kết hợp với phổ khối để xác định cấu trúc phân tử?

Trả lời: Một số kỹ thuật khác có thể kết hợp với phổ khối bao gồm: sắc ký khí (GC) và sắc ký lỏng (LC) để phân tách hỗn hợp trước khi phân tích khối phổ; phổ UV-Vis để xác định sự hiện diện của các nhóm chromophore; phương pháp nhiễu xạ tia X để xác định cấu trúc tinh thể của các phân tử ở trạng thái rắn.

Hạn chế chính của việc sử dụng phổ khối để xác định cấu trúc là gì?

Trả lời: Một số hạn chế của phổ khối bao gồm: Một số phân tử có thể không tạo ra ion phân tử hoặc tạo ra phổ quá phức tạp khó giải thích; phổ khối không cung cấp thông tin trực tiếp về cấu trúc không gian ba chiều của phân tử; khối phổ yêu cầu mẫu ở dạng khí hoặc ion, do đó không phù hợp với tất cả các loại mẫu; đồng phân có thể có phổ khối rất giống nhau, gây khó khăn cho việc phân biệt.